36种PCR的原理、用途、特点总结

 

来源公众号：扫地生生物　作者：生物冯老师

摘要

      PCR是高考非常喜欢考察的技术，现在对36种PCR的原理、用途、特点进行总结，希望对大家有所帮助。

目录

01. 扩增片段长度多态性（AFLP）PCR 

02. 等位基因特异性PCR 

03. Alu-PCR 

04. 组装PCR 

05. 不对称PCR 

06. 低温变性共扩增聚合酶链反应（COLD PCR） 

07. 菌落PCR 

08. 常规PCR 

09. 数字PCR（dPCR） 

10. 快速循环PCR 

11. 高保真PCR 

12. 高分辨率熔解曲线（HRM）PCR 

13. 热启动PCR 

14. 原位PCR 

15. 序列间特异性（ISSR）PCR 

16. 反向PCR 

17. LATE（线性指数后阶段）PCR 

18. 连接介导PCR 

19. 长片段PCR 

20. 甲基化特异性PCR（MSP） 

21. 小引物PCR 

22. 多重PCR 

23. 纳米颗粒辅助PCR（纳米PCR） 

24. 巢式PCR 

25. 重叠延伸PCR 

26. 实时荧光定量PCR（qPCR） 

27. 重复序列基PCR 

28. 逆转录酶（RT-PCR） 

29. 逆转录实时定量PCR（RT-qPCR） 

30. 核糖核酸酶H依赖性PCR（rhPCR） 

31. 单一特异性引物PCR（SSP-PCR） 

32. 固相PCR 

33. 自杀式PCR（防污染PCR） 

34. 热不对称交错PCR（TAIL-PCR） 

35. 降落PCR（TD-PCR） 

36. 可变数目串联重复序列（VNTR）PCR 

具体内容

1. 扩增片段长度多态性（AFLP）PCR

• 这是一种基于PCR的技术，通过选择性扩增酶切后的DNA片段区域，为特定基因组生成独特的指纹图谱。

• 这项技术能够在无需预先了解基因组序列的情况下，快速为任何生物体生成大量的标记片段。

• AFLP PCR技术利用限制性内切酶来消化基因组DNA，并使接头能够连接到这些DNA片段的黏性末端上。

• 然后，选取部分限制性酶切片段，使用与衔接子序列互补的引物对其进行扩增。

• 扩增后的序列在变性琼脂糖凝胶电泳中进行分离并可视化呈现。

• 扩增片段长度多态性聚合酶链式反应（AFLP PCR）被应用于多种领域，例如评估物种内部或近缘物种之间的遗传多样性，推断种群层面的系统发育关系和生物地理模式，绘制遗传图谱以及确定不同栽培品种之间的亲缘关系。

2.等位基因特异性聚合酶链式反应（PCR）

• 等位基因特异性聚合酶链式反应（AS-PCR）是一项基于等位基因特异性引物的技术，该技术可用于分析单核苷酸多态性。

• 等位基因特异性聚合酶链式反应（AS-PCR）也被称为扩增阻滞突变系统（ARMS-PCR），它针对两种不同的等位基因使用两种不同的引物。

• 一种是突变型引物组，这类引物难以（抵抗）参与正常的聚合酶链式反应（PCR），另一种是正常引物组，它们难以参与突变型的聚合酶链式反应。

• 这些引物的3’端经过修饰，从而使一组引物能够扩增正常等位基因，而另一组引物则能扩增突变等位基因。

• 这种错配使得引物能够特异性地扩增单个等位基因。

• 它广泛应用于单基因点突变检测，比如镰状细胞贫血症和地中海贫血症的检测。

• 它还可用于直接确定ABO血型的基因型。

3.Alu序列聚合酶链式反应（Alu-PCR）

• Alu序列聚合酶链式反应是一种快速且简便的DNA指纹图谱技术，它基于对众多被Alu重复元件环绕的基因组位点的同步分析。

• Alu元件是一段短的DNA序列，Alu元件最初通过来源于黄褐节杆菌（Arthrobacter luteus）的限制酶AluI鉴定。

• Alu元件是最为丰富的转座元件之一，在整个人类基因组中都能找到。它们在进化过程中发挥着作用，并且已被用作遗传标记。

• 在Alu序列聚合酶链式反应中，会使用两条与这些序列互补且标记有荧光染料的引物来进行聚合酶链式反应，然后对聚合酶链式反应的产物进行分析。

• Alu元件的插入现象已在一些人类遗传性疾病以及多种类型的癌症中被发现。因此，这种聚合酶链式反应在检测这些疾病和突变方面起着至关重要的作用。

4. 组装聚合酶链式反应（组装PCR）

• 组装PCR是一种借助多个较短片段组装大片段DNA寡核苷酸的方法。

• 常规PCR中引物长度通常为18-25个碱基对，而组装PCR中采用更长的寡核苷酸（如50个碱基对），以确保正确杂交。

• 在PCR循环过程中，寡核苷酸会与互补片段结合，随后由聚合酶填补（序列空隙）。

• 因此，这种PCR的每个循环都会基于寡核苷酸的互补配对情况，随机增加不同片段的长度。

• 组装PCR可用于提高目标蛋白的产出量，也能为结构研究或生化研究制备大量RNA。

5.不对称聚合酶链式反应（不对称PCR）

• 不对称PCR是PCR的一种改良形式，用于优先扩增原始DNA的某一条链，使其扩增量超过另一条链。

• 它与常规PCR的区别在于：针对特定链使用了过量引物。

随着不对称PCR的推进，低浓度的“限制性引物”会定量整合到新合成的双链DNA中，并逐渐消耗殆尽。

• 最终，当限制性引物耗尽后，过量引物会引发目标单链DNA的线性合成。

• 当只需扩增两条互补链中的某一条时（如在测序、杂交探针技术中），不对称PCR就显得尤为实用。

6.低温变性共扩增聚合酶链反应（COLD-PCR）

• 基于降低变性温度的共扩增聚合酶链式反应（COLD-PCR）是一种新型PCR技术，能够从野生型与含突变（或含变体）序列的混合物中选择性扩增低丰度DNA变体，且不受突变类型或其在扩增子上位置的影响。

• 该方法通过调整临界温度实现选择性扩增，在该温度下含突变的DNA会优先于野生型解链。

• 在变性后设置中间退火步骤，允许野生型与突变等位基因杂交。这种错配会轻微改变双链DNA的解链温度。

• 这些异源双链会发生解链并作为模板，从而在后续PCR循环中显著提高次要变体DNA的扩增比例。

• COLD-PCR在肿瘤学标本的突变检测中具有重要作用，尤其适用于异质性肿瘤及体液样本。

• 该技术还可辅助评估手术或化疗后的残留病灶、进行疾病分期以及分子分型，从而为患者预后判断和个体化治疗方案制定提供依据。

7.菌落聚合酶链式反应（Colony PCR）

• 菌落聚合酶链式反应是这样一种方法：通过设计插入DNA的特异性引物，来鉴定质粒中所插入的目标DNA。

• 对于含有质粒的细菌菌落，能够直接运用两组引物进行扩增。

• 第一组是插入片段特异性引物，它的作用是扩增插入序列；另一组是载体特异性侧翼引物，其功能是扩增除插入DNA之外的质粒DNA。

• 具体操作是，挑取一个细菌菌落，直接将其加入到包含所有其他PCR试剂的预混液中。

• 菌落PCR的主要应用在于，确认DNA是否正确连接并插入到细菌以及酵母质粒中。

8.常规聚合酶链式反应（Conventional PCR）

• 聚合酶链式反应（PCR）是一种在试管中进行的DNA复制体系，它能够让特定的“目标”DNA序列在短短几个小时内选择性地扩增数百万倍。

• PCR借助DNA聚合酶（这种酶参与细胞遗传物质的复制过程）来实现特定DNA片段的合成。

• 当一个小片段（引物）连接到DNA链上选定的特定起始合成位点时，该酶就会合成DNA的互补序列。

• 引物限定了要复制的序列范围，最终的结果是某个特定DNA序列得到扩增，产生数十亿个拷贝。

• 常规PCR在以下领域都有应用：选择性DNA分离、DNA的扩增与定量、医学和诊断方法、传染病诊断、法医学研究以及科研领域。

9.数字聚合酶链式反应（dPCR）

• 数字聚合酶链式反应（dPCR）是一种定量PCR技术，能够灵敏高效地测量样本中DNA或RNA的含量。

• 在dPCR中，初始样本混合液会在扩增步骤前被分割成大量单独的微反应单元，每个微反应单元中可能存在或不存在目标序列。

• 通过检测扩增后反应孔中是否存在荧光信号，可计算原始样本中目标序列的绝对数量。

• 发出荧光信号的微反应单元被判定为阳性（记为“1”），无荧光信号的微反应单元为阴性（记为“0”）。

• 最终通过统计分析确定初始样本中目标序列的浓度。

• dPCR主要用于测定各种临床标本中DNA和RNA病毒、细菌及寄生虫的总量，尤其适用于缺乏标准化校准品的场景。

10.快速循环聚合酶链式反应

• 快速循环聚合酶链式反应是一种基于PCR的技术，能够显著缩短循环时间以完成特定PCR产物的扩增。

• 其原理与常规PCR相同，唯一区别在于扩增时间的大幅压缩。

• 该PCR所使用的缓冲液可增强Taq DNA聚合酶对短单链DNA片段的亲和力，使引物退火时间缩短至仅5秒。

• 快速循环PCR对需要快速循环的流程至关重要，同时有助于疾病和突变的快速诊断。

11.高保真聚合酶链式反应

• 高保真聚合酶链式反应是一种改良的PCR方法，采用具有低错误率的DNA聚合酶，确保目标DNA复制的高度准确性。

• 此类酶在扩增过程中对正确的核苷三磷酸具有显著的结合亲和力。

• 当聚合酶活性位点发生错误结合时，由于活性位点复合物的结构特性，核苷酸掺入速度会减缓。

• 高保真扩增对于那些实验结果依赖于正确DNA序列的研究至关重要，例如克隆、单核苷酸多态性（SNP）分析以及下一代测序（NGS）应用。

12.高分辨率熔解曲线（HRM）聚合酶链式反应

• 这是一种用于检测双链DNA样本中突变、多态性和表观遗传差异的高效技术。

• 相较于测序和Taqman SNP分型等其他基因分型技术，它具有显著的成本优势，使其成为大规模基因分型项目的理想选择。

• 该技术兼具快速与高效特性，能够在短时间内准确完成海量样本的基因分型。

• 操作简便。只要拥有一台具备HRM功能的实时PCR仪，即使是非遗传学家也能在任何实验室中通过高质量的HRM检测实现高效基因分型。通过结合荧光染料的双链DNA在升温过程中解链，荧光信号变化反映熔解曲线差异，检测序列变异（如突变、SNP 或甲基化）

13.热启动聚合酶链式反应

• 热启动PCR是常规聚合酶链式反应（PCR）的一种改良形式，旨在减少室温下非特异性DNA扩增导致的非预期产物和引物二聚体形成。

• 其基本原理是将一种或多种试剂与反应混合物分离，直至混合物加热至变性温度。

• 热启动PCR显著降低了非特异性结合和引物二聚体的形成，并通常提高产物产量。它还简化了操作流程，降低了污染风险。

14.原位聚合酶链式反应

• 原位聚合酶链式反应（In-situ PCR）是一种有效的方法，可在冷冻或石蜡包埋的细胞或组织切片中检测微量稀有核酸序列，并定位这些序列在细胞内的分布。

• 该方法首先通过组织固定保存细胞形态，随后用蛋白水解酶处理，为PCR试剂作用于目标DNA提供通道。

• 目标序列经试剂扩增后，通过标准免疫细胞化学方法进行检测。

• 原位PCR适用于传染病诊断、DNA定量分析、微量DNA检测，并广泛应用于器官发生和胚胎发育研究。

15.序列间特异性（ISS）PCR

• 序列间特异性PCR（ISSR-PCR）是一种DNA指纹分析技术，通过选择全基因组重复的特定序列片段作为引物，生成独特的指纹图谱。

• 该技术利用通常为16-25碱基对的微卫星序列作为单引物PCR反应的引物，靶向多个基因组位点，主要扩增不同大小的SSR间序列。

• ISSR-PCR可用于基因组指纹分析、遗传多样性与系统发育研究、基因组作图及基因标记。

16.反向聚合酶链式反应

• 反向聚合酶链式反应（Inverse PCR）是聚合酶链式反应的众多变体之一，用于在仅知一段序列时扩增DNA。

• 常规PCR需要与目标DNA两端互补的引物，而反向PCR即使仅有一段可设计引物的已知序列，也能完成扩增。

• 反向PCR包括一系列限制性酶切和连接步骤，最终形成环状片段，从而通过单段已知序列启动PCR。将酶切后的 DNA 片段环化，使已知序列位于环内侧，从而通过外侧引物实现未知区域的扩增

• 随后，与其他PCR过程类似，DNA由温度敏感型DNA聚合酶进行扩增。

• 反向PCR在确定宿主DNA中各类转座子和逆转录病毒插入位置方面尤为有用。

17.指数期后线性扩增（LATE）PCR

• LATE-PCR是不对称PCR的改良形式，使用熔解温度高于过量引物的限制性引物，从而在反应中期限制性引物浓度下降时仍能维持反应效率。

• LATE-PCR起始于指数扩增阶段，此时其扩增效率与常规PCR相似。一旦限制性引物耗尽，反应会突然切换为线性扩增模式，并在后续多个热循环中持续生成单链产物。

18.连接介导聚合酶链式反应

• 连接介导的PCR是常规PCR的一种改良形式，其特点是最初只需知道目标DNA一端的序列信息，随后通过连接一个独特的DNA接头来添加另一端的序列。

• 该技术利用称为“接头”（或衔接子）的小DNA片段，首先将其连接到目标DNA的片段上。

• 然后设计与接头序列互补的PCR引物，用于扩增目标片段。

• 这种方法广泛应用于DNA测序、基因组步移以及DNA足迹分析等领域。

19.长距离聚合酶链式反应

• 长距离PCR是一种用于扩增常规PCR方法或试剂难以处理的较长DNA片段的技术。

• 通过使用改良的高效聚合酶（具有增强的DNA结合能力），可实现长片段的高持续性和准确性扩增。

• 该方法能够在较短时间内高效扩增更长的目标序列，节省资源。

20.甲基化特异性聚合酶链式反应（MSP）

• 甲基化特异性PCR（MSP）是一种用于检测和分析CpG岛中DNA甲基化状态的方法。

• 进行MSP时，需对DNA进行亚硫酸氢盐处理，并使用两对引物分别扩增可检测的甲基化和未甲基化DNA。亚硫酸氢盐处理将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶（5-甲基胞嘧啶）保持不变。

• DNA经亚硫酸氢盐处理后，胞嘧啶转化为尿嘧啶，随后通过特异性引物选择性扩增甲基化序列。

• 检测甲基化模式至关重要，因为启动子区域中CpG二核苷酸的过度甲基化会抑制基因表达。

21.小引物聚合酶链式反应

• 小引物PCR是一种使用工程改造聚合酶和10核苷酸“小引物”的新型PCR方法。

• 该方法能够揭示标准引物无法检测到的新型16S rRNA基因序列。

• 小引物PCR采用热稳定聚合酶，可从短引物（9或10个核苷酸）起始延伸。

• 这种方法允许PCR靶向更小的引物结合区域，用于扩增高度保守的DNA序列，如16S（或真核生物18S）rRNA基因。

• 小引物通常靶向 16S rRNA 基因等高度保守区域的 9-10 核苷酸短序列，通过热稳定聚合酶实现特异性扩增

22.多重聚合酶链式反应（Multiplex PCR）

• 多重聚合酶链式反应是一种常用的分子生物学技术，可在单次PCR检测中同时扩增多个目标序列。

• 在多重PCR中，通过热循环仪利用多对引物和温度介导的DNA聚合酶进行DNA扩增。

• 所有为多重PCR设计的引物对都必须经过优化，确保在PCR过程中所有引物对的最佳退火温度一致。

• 当同时靶向多个序列时，单次检测即可生成额外信息，而传统方法需要消耗更多试剂并投入大量时间和精力。

• 该技术已广泛应用于基因分型、突变与多态性分析、微卫星STR分析、病原体或转基因生物检测等领域。

• 在诊断实验室中，多重PCR可有效检测引发同类疾病的不同微生物。

23.纳米颗粒辅助聚合酶链式反应（nanoPCR）

• 纳米颗粒辅助PCR是通过添加具有特定物理性质的小分子物质来增强反应效果的技术。

• 关于金纳米颗粒的作用机制，一种理论认为这些颗粒会吸附部分聚合酶，调控系统中剩余聚合酶的量，从而可能提高反应特异性。

• 另一种理论指出，纳米颗粒可吸附引物对，降低完全配对与错配引物形成双链时的解链温度，进而增强反应特异性。

• 纳米颗粒相关PCR具有高灵敏度、高特异性和高选择性的优势，已广泛应用于病毒检测和基因测序领域。

24.巢式聚合酶链式反应（Nested PCR）

• 巢式聚合酶链式反应（Nested PCR）是PCR技术的一种改良方法，通过使用两组引物防止非特异性结合，从而显著增强反应的特异性。

• 第一组引物结合在目标DNA的外侧区域并扩增较大片段，而另一组引物则特异性结合于目标位点。

• 在第二轮扩增中，第二组引物仅对目标DNA进行扩增。

• 巢式PCR在系统发育研究和不同病原体检测中具有重要作用。

• 该技术具有更高的灵敏度，因此即使样本中DNA含量较低也能实现扩增，而这在常规PCR技术中是不可行的。

25.重叠延伸聚合酶链式反应（OE-PCR）

• 该方法也称为“重叠延伸剪接”（Splicing by Overlap Extension）或SOEing。

• 重叠延伸PCR是一种重要技术，常用于克隆大型复杂片段、编辑已克隆基因或融合两个基因元件。

• 它通过短片段拼接生成完整长链DNA。

• 该技术可实现高效基因克隆及多位点定向大片段插入、缺失和替换。

• 实践证明，它在定点诱变、嵌合分子构建甚至通过拼接小片段克隆大片段基因方面均具有显著优势。

26.实时定量聚合酶链式反应（qPCR）

• 定量PCR（qPCR），又称实时PCR或实时定量PCR，是一种基于PCR的技术，将目标DNA序列的扩增与反应体系中该DNA物种的浓度定量相结合。

• 传统PCR需通过凝胶电泳分析产物，耗时较长。而qPCR通过在指数期实时检测产物，简化了分析流程。

• 实时PCR的原理依赖于荧光染料的使用。

• 样本中核酸的浓度通过荧光染料或荧光标记的寡核苷酸进行定量。

• qPCR广泛应用于基因分型与病原体定量、微小RNA分析、癌症检测、微生物载量测试及转基因生物（GMOs）检测。

27.基于重复序列的聚合酶链式反应（rep-PCR）

• 基于重复序列的PCR（rep-PCR）是一种改良的PCR技术，使用靶向散布于细菌基因组中的非编码重复序列的引物。

• 这些非编码重复序列块可作为寡核苷酸探针的多个遗传靶点，从而为单个细菌菌株生成独特的DNA图谱或指纹。

• rep-PCR的主要应用是不同细菌的分子菌株分型，也用于多种病原体的流行病学鉴别。

28.逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）

• 逆转录PCR（RT-PCR）是常规PCR的改良技术，首先将RNA分子逆转录为互补DNA（cDNA），再通过PCR进行扩增。

• 在RT-PCR中，RNA模板首先通过逆转录酶转化为cDNA，随后cDNA作为模板进行指数级PCR扩增。

• RT-PCR可在单管内完成或分两步在不同管中进行。一步法RT-PCR操作简便，但需严格防污染；两步法分阶段操作，灵活性更高。

• RT-PCR广泛应用于研究方法、基因插入、遗传疾病诊断及癌症检测。

29.逆转录实时定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）

• RT-PCR常与q-PCR结合形成逆转录实时定量PCR（RT-qPCR）

• 这使得在扩增后能够实时定量DNA。

30.RNase H依赖性聚合酶链式反应

• 在RNase H依赖性PCR中，引物3’端带有可移除的扩增阻断结构(使用 3′ 端含 RNA 残基的嵌合引物，RNase H 在高温下切割 RNA-DNA 杂合体，释放引物进行延伸)。

阻断引物能否扩增取决于RNase H酶在与互补靶序列杂交时的切割活性。

• RNase H酶在低温下活性极低，无需修饰DNA聚合酶即可实现热启动。

• 同样，当RNA残基附近存在错配时，酶的切割效率降低。

• 因此，在RNase H酶作用下，非特异性结合和引物二聚体形成减少，有效促进特异性杂交。

31.单特异性引物聚合酶链式反应（SSP-PCR）

• 单特异性引物PCR（SSP-PCR）是一种基于PCR的技术，允许仅利用部分序列信息对基因进行扩增。

• 该技术支持从染色体已知区域向未知区域的单向基因组步移。

• 这允许即使仅在一端有可用序列信息时仍能进行双链DNA的扩增。

• 这种单特异性引物PCR（SSP-PCR）方法允许对仅有部分序列信息的基因进行扩增，并允许从染色体已知区域向未知区域进行单向基因组步移。

32.固相聚合酶链式反应

• 固相PCR（SP-PCR）是一种独特的PCR技术，允许在固相支持物表面扩增目标核酸，其中一个或两个引物被固定在表面上。

• 引物的空间分离显著减少了不良的引物相互作用，从而防止了引物二聚体的形成，并允许更高多重性的扩增。

• 这种新方法的核心思想是将引物的5’端连接到表面，而不是让引物在本体溶液中自由扩散。

• 自由扩散的DNA靶标可以被捕获到表面，然后由聚合酶复制。

• 复制产物保持附着在表面，而初始DNA分子在退火步骤后返回溶液。

• 附着的复制产物的自由端与表面上互补的引物杂交，从而启动扩增过程。

33.自杀聚合酶链式反应

• 自杀PCR常用于需要避免假阳性且确保扩增片段特异性最高的研究中。

• 该方法要求任何引物组合仅在PCR中使用一次，且不得用于任何阳性对照PCR反应。

• 这些引物必须始终靶向从未使用过该特定引物或任何其他引物组进行过扩增的基因组区域。

• 这种安排确保实验室中不存在来自先前PCR反应的污染DNA，否则可能导致假阳性结果。

• 自杀PCR用于古遗传学研究，该研究涉及对古代生物遗骸中保存的遗传物质进行检测。通过严格限定引物的使用范围，防止实验室交叉污染，尤其适用于痕量 DNA 分析（如古 DNA、法医样本）

34.热不对称交错聚合酶链式反应（TAIL-PCR）

• TAIL-PCR是用于回收已知序列相邻DNA片段的强大工具。

• TAIL-PCR在连续反应中利用三组嵌套引物和一个具有低解链温度的任意简并引物，从而通过温度控制特异性与非特异性产物的相对扩增频率。过高温循环优先扩增特异性产物，低温循环允许任意简并引物与未知序列结合，结合嵌套引物提高特异性

• 该方法具有高度准确性，未经纯化的TAIL-PCR产物可直接进行测序。

• 它还允许克隆全长功能基因。

35.降落聚合酶链式反应（Touch Down PCR）

• 降落PCR是PCR的一种改良方法，其初始退火温度高于引物的最佳解链温度（Tm），并在后续循环中逐渐降低，直至达到Tm温度或“降落温度”。

• 降落PCR在较高温度下提高反应的特异性，并通过降低退火温度在后期提高扩增效率。

36.可变数目串联重复序列（VNTR）PCR

• 它们是法医学个体识别的重要标记。

• 在VNTR PCR中，扩增的片段在物种内变异极小，但在物种间表现出差异。

• 它能够通过聚合酶链式反应（PCR）从极少量的基因组脱氧核糖核酸（DNA）中成功扩增。

• 在基因分型工具中，基于PCR的可变数目串联重复序列（VNTR）分析是结核分枝杆菌分型的一种有前景的方法。

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