PCR反应中的解链温度，退火温度，延伸温度解析

 

来源公众号：科研民工芝士草莓 

今天我们全面解析PCR反应中的解链温度，退火温度，延伸温度是什么

一.解链温度

解链温度是指双链核酸分子（DNA或RNA）在解链过程中，紫外吸收值（通常在260nm波长下测定）达到最大变化值的一半时所对应的温度。此时，双链核酸分子中有50%的碱基对发生解离，形成单链。

解链温度是PCR反应的初始关键步骤，通常设定在94°C至98°C的范围内。在这一高温环境下，DNA的双链会被解开，分离成单链状态，从而使其碱基序列得以暴露，为接下来的引物结合提供便利。如果温度设置过低，DNA可能无法完全解链，进而影响反应效率；而温度过高，则有可能对DNA或其他反应成分造成破坏。

解链温度的影响因素：

1.碱基组成：核酸分子中碱基的种类和比例对解链温度有显著影响。G（鸟嘌呤）和C（胞嘧啶）之间形成三个氢键，比A（腺嘌呤）和T（胸腺嘧啶）之间形成的两个氢键更稳定。因此，G+C含量越高的核酸分子，其解链温度也越高。

2.核酸长度：核酸分子的长度越长，解链时所需的能量也越高，因此解链温度也相应升高。

3.溶液条件：包括盐浓度、pH值等。盐浓度增加会屏蔽核酸分子上的负电荷，减少静电斥力，从而有利于双链的稳定，提高解链温度。pH值的变化也可能影响碱基之间的氢键强度，进而影响解链温度。

二.退火温度

退火温度：指在PCR过程中，引物与模板DNA结合时的温度。当50%的引物与模板DNA的互补序列形成双链DNA分子时，所对应的温度即为退火温度。这个温度是确保引物与目的序列有效结合，同时减少非特异性结合的重要条件。

退火温度的影响因素：

1.引物特性：引物的长度、碱基组成和二级结构等都会影响退火温度的选择。一般来说，引物越长，退火温度可以稍高一些；G+C含量高的引物也需要较高的退火温度。

2.模板DNA的特性：模板DNA的复杂性和浓度也会影响退火温度的选择。对于复杂的模板DNA，可能需要较低的退火温度以确保引物能够与目的序列有效结合。

三.延伸温度

延伸温度：是指在引物与模板DNA成功结合后，DNA聚合酶开始催化合成新的DNA链时的温度。延伸温度的选择通常基于所使用的DNA聚合酶的最适温度范围。对于Taq DNA聚合酶，其最适温度范围一般在70至80℃之间，因此延伸温度常选择为72℃。这个温度既保证了DNA聚合酶的高活性，又有利于引物与模板DNA的稳定结合。

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