微生物分离、纯化与鉴定标准流程解析

 

来源公众号：微生物菌种网

微生物学研究的基石在于获得纯净、明确的微生物培养物。分离、纯化与鉴定是达成此目标的标准化三部曲，贯穿于环境监测、临床诊断、工业发酵和基础科研等众多领域。掌握其核心流程与规范，是保证实验结果可靠性和可重复性的关键。

一、 微生物分离：从混合体到单菌落

目标：从含有多种微生物的复杂样品（土壤、水体、临床样本、食品等）中，将目标微生物或不同种类的微生物区分开来，获得独立的菌落。

标准流程：

1、样品采集与预处理：

无菌操作： 全程在无菌条件下进行（超净工作台/生物安全柜），使用无菌容器和工具。

代表性： 根据目标选择合适的采样点和方式。

预处理： 可能包括均质化、梯度稀释（降低微生物浓度，利于获得单菌落）、过滤、离心富集、或选择性富集培养（如特定温度、pH、添加抑制剂或营养物）以增加目标微生物比例。

2、选择与制备培养基：

基础培养基： 满足广泛微生物生长（如营养琼脂、TSA）。

选择性培养基： 添加抑制剂（如抗生素、染料、盐）抑制非目标微生物生长（如EMB抑制G⁺菌，SS琼脂抑制非肠道菌）。

鉴别培养基： 添加指示剂（如pH指示剂、特定底物）使不同微生物产生可区分的特征（如麦康凯琼脂区分乳糖发酵菌）。

针对性： 根据目标微生物的营养需求和特性选择：

正确配制与灭菌： 严格按配方配制，经高压蒸汽灭菌（121°C, 15-30分钟）或过滤除菌。

倾注平板： 将灭菌后冷却至适宜温度（约45-50°C）的培养基无菌倾倒入无菌培养皿中，凝固后形成平板。

3、接种与培养：

常用方法：

涂布平板法： 将一定量（通常0.1ml）的样品稀释液滴于平板中央，用无菌涂布棒均匀涂布整个表面。

倾注平板法： 将一定量样品稀释液加入无菌培养皿，再倒入熔化的培养基，混匀凝固。

平板划线法： 最常用的分离纯化起始方法。用接种环沾取样品，在平板表面进行分区划线，通过逐区稀释，最终在末区获得单个、孤立的菌落。

培养条件：

温度： 根据目标微生物设定（常见25-30°C环境菌，37°C人体病原菌，55°C嗜热菌）。

气体环境： 需氧（有氧）、厌氧（无氧）、微需氧（低氧）、或增加CO₂（如5-10%）。

时间： 根据微生物生长速度确定（通常24-72小时，有些需数周）。

4、观察与记录： 培养后观察平板上菌落的形态、大小、颜色、边缘、透明度、隆起度等特征，并记录分离结果。

二、 微生物纯化：获得纯培养

目标：确保一个菌落来源于且仅来源于一个微生物细胞（或孢子），排除任何其他微生物的污染，得到纯培养物。

标准流程：

1、挑取单菌落：

在分离良好的平板上，挑选形态单一、典型且相互分离良好的单个菌落。

使用无菌接种针或接种环，轻轻接触目标菌落的边缘或中心。

2、再次划线分离：

将挑取的菌落转移到新的、成分合适的培养基平板上，再次进行平板分区划线。

此步骤至关重要，目的是通过物理稀释，确保新平板上的菌落是由原始单菌落繁衍而来。

3、纯化培养与验证：

在设定的条件下培养新的划线平板。

观察新平板上的菌落形态：所有菌落应具有高度一致的形态学特征（大小、形状、颜色、边缘、光泽等）。若形态不一致，则表明不纯，需重复步骤1-2进行再纯化。

4、纯培养物保存：

将验证为纯培养的典型单菌落接种到斜面培养基或穿刺培养基上。

培养后，根据微生物特性选择合适的短期（4°C）或长期（-80°C甘油冻存、冷冻干燥）保存方法，并清晰标注信息（菌株号、日期、来源等）。

三、 微生物鉴定：揭示“身份”

目标：综合运用多种方法，确定纯培养微生物的分类地位（通常到种或属水平）。

标准流程（多技术联用）：

1、形态学观察：

菌落形态： 详细记录在固体培养基上的特征（大小、形状、边缘、隆起、颜色、表面、质地、透明度、溶血性等）。

细胞形态与染色：

革兰氏染色： 最基础、最重要的鉴别染色，区分G⁺（紫色）和G⁻（红色）细菌。

特殊染色： 芽孢染色、荚膜染色、抗酸染色等用于特定类群。

显微镜观察： 光学显微镜观察细菌的形状（球菌、杆菌、螺旋菌）、大小、排列方式、特殊结构（鞭毛、芽孢、荚膜）；真菌观察菌丝、孢子形态。

2、生理生化特性测定：

代谢能力测试：

碳源/氮源利用： 如糖（醇、苷）发酵试验（产酸/产气）、柠檬酸盐利用试验。

酶活性： 如氧化酶试验、过氧化氢酶（触酶）试验、凝固酶试验、脲酶试验、吲哚试验（色氨酸酶）、硫化氢试验、明胶液化试验、硝酸盐还原试验等。

生长特性： 不同温度、pH、盐浓度下的生长情况；需氧性试验。

方法： 使用商品化的微量生化鉴定系统（如API 20E, VITEK, Biolog）或传统试管法。将待测菌接种到含特定底物的检测管或微孔中，培养后观察颜色变化（指示pH变化或底物消耗）或产生气体等现象。

3、分子生物学鉴定：

16S rRNA基因测序（细菌） / 18S rRNA基因或ITS区测序（真菌）：

原理： 提取微生物基因组DNA，PCR扩增其保守的核糖体RNA基因片段（如细菌的16S rRNA基因），进行测序。

比对分析： 将获得的序列与大型数据库（如GenBank, EzBioCloud, SILVA）进行比对，寻找最相似（同源性最高）的已知序列，从而确定其种属分类。这是目前最准确、最通用的鉴定手段，尤其对于难以培养或表型不典型的微生物至关重要。

其他分子方法： 特定基因检测（如毒力基因）、多位点序列分型（MLST）、脉冲场凝胶电泳（PFGE）、全基因组测序（WGS）用于更精细的分型和溯源。

4、数据整合与报告： 综合分析形态学、生理生化和分子生物学结果，参考权威分类手册（如《伯杰氏系统细菌学手册》）或数据库信息，得出最终鉴定结论，并出具鉴定报告。

关键注意事项与标准要求

无菌操作贯穿始终： 防止环境微生物污染样品或培养物，以及待测菌污染环境。

培养基质量控制： 使用有效期内的合格培养基，必要时进行无菌试验和生长试验。

培养条件标准化： 严格控制温度、湿度、气体环境和培养时间。

记录完整可追溯： 详细记录样品信息、操作步骤、所用试剂/培养基批号、培养条件、观察结果、鉴定数据等。

生物安全： 处理未知或潜在病原微生物时，必须在相应生物安全等级（BSL）的实验室进行，遵守防护规范。

质量控制菌株： 在关键试验（如染色、生化试验）中使用已知阳性和阴性对照菌株验证试剂和方法的有效性。

交叉验证： 单一方法可能存在局限性，应结合多种方法结果进行综合判断。

结语

微生物的分离、纯化与鉴定是一套严谨、规范、环环相扣的科学流程。从复杂的自然环境中锁定目标，到获得纯净的单克隆培养物，再到运用传统与现代技术揭示其“身份”，每一步都离不开标准的操作规范和对细节的严格把控。掌握这套核心流程，不仅是微生物学研究和应用的基础技能，更是确保数据准确性、实验可重复性和结果可靠性的根本保障。随着分子生物学技术的飞速发展，鉴定手段日益精准高效，但经典的分离纯化技术和表型鉴定方法，因其直观、经济和对微生物生理特性的直接反映，仍具有不可替代的价值，共同构成了现代微生物鉴定的完整体系。

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