在细菌内，导入的质粒和细菌原质粒发生同源重组后，为什么导入的质粒有可能会变成线性？

 

来源公众号：学甫无境　缺人教版：王甫荣

问题的提出：在昨天的推文中，有老师提出：“同源交换后，质粒2的环形结构被打破（或形成非功能性线性序列），无法自主复制（质粒复制依赖完整环形结构）”。如推文中的质粒2，为什么会形成非功能性线性序列？

在细菌中，导入的质粒与细菌原有质粒发生同源重组后，导入的质粒之所以可能变成线性，核心原因与同源重组过程中DNA的断裂、重接方式以及环状质粒的结构稳定性有关。具体可从以下角度分析：

1. 同源重组的本质：DNA双链断裂与重接

同源重组的核心过程涉及DNA 双链的断裂、同源序列配对、片段交换和重新连接。对于环状质粒而言，其维持环状结构的关键是DNA分子两端通过磷酸二酯键闭合连接。当导入的环状质粒与细菌原质粒（环状）存在同源序列时，重组会在同源区域启动：

首先，同源序列区域的DNA双链发生断裂（由重组相关酶如属于λ噬菌体的Red重组系统介导），形成具有游离末端的单链或双链片段；随后，断裂的片段与同源序列配对、交换，最终通过 DNA 连接酶等修复酶重新连接。示意图如下：

具体的同源重组机制有点复杂，科学家还在不断研究中，2021年由我国科学家孔道春团队揭示DNA同源重组的关键机制，部分机制示意图如下：

DNA双链发生断裂，启动同源重组修复程序。核酸酶降解断裂末端的5’链，形成3’突出的单链（ssDNA），为后续链侵入做准备。单链侵入同源双链，置换出一条链形成D-环，以同源链为模板，DNA聚合酶延伸3’单链，合成新DNA填补缺口，形成Holliday交叉（十字形DNA中间体）。Holliday交叉沿DNA移动，扩大异源双链区域，两条 DNA 可以发生片段交换。

2. 单交换重组导致环状结构破坏

在同源重组中，若导入的质粒与原质粒发生单交换（一次交叉互换），可能直接破坏环状质粒的闭合结构：两个环状 DNA（导入质粒和原质粒）在同源区域发生单次交叉后，会形成一个 “共整合体”—— 即两个环状分子通过重组位点连接成一个更大的环状 DNA（类似两个环套在一起）。但这种情况通常不会产生线性 DNA。

然而，若导入的质粒本身存在结构缺陷（如缺乏完整的复制子或环化元件），或重组发生在质粒的关键环化区域（如末端重复序列），单交换可能导致断裂的 DNA 末端无法重新闭合为环：断裂的一端与原质粒连接，另一端则成为游离的线性末端，最终使导入的质粒片段以线性形式存在。

3. 双链断裂未正确环化修复

同源重组中，DNA 双链断裂是关键步骤。对于环状质粒，断裂后需要通过修复酶将两端重新连接以维持环状。但若修复过程出现异常，例如，断裂的双链末端未被正确识别或连接酶未高效催化环化，断裂的质粒就无法重新闭合为环，从而形成线性DNA。此外，若导入的质粒与原质粒的同源序列较短或重组效率较低，断裂后的DNA末端可能因缺乏足够的同源序列引导正确连接，导致线性化。

4. 自杀质粒的特殊性加剧线性化

若导入的是自杀质粒（一类无法在宿主细胞中自主复制，仅能通过同源重组整合到宿主基因组或其他可复制的质粒中，且完成重组后会被宿主主动清除的工具质粒），其线性化概率更高。自杀质粒通常不含宿主的复制子，无法独立维持环状结构。若重组未成功整合到原质粒或DNA上，断裂后的质粒无法环化复制，只能以线性形式存在，并最终被细菌的核酸酶降解。

因此，同源重组后环状质粒形成非功能性线性序列的原因主要三个方面，导入的质粒在与原质粒同源重组后，单交换导致结构缺陷、修复异常或自杀质粒未成功整合，从而导致环状质粒的闭合结构被破坏，就会形成线性DNA。线性化的质粒因缺乏环状结构的稳定性，通常难以在细菌中长期存在，这也是同源重组筛选中区分成功整合与未整合质粒的重要机制之一。

试题：同源重组基因敲除技术是将同源DNA 片段导入受体细胞，利用同源 DNA 片段的互换，用其他DNA 片段在原有位置替代靶基因，从而实现基因的敲除。米曲霉产生的曲酸具有抗菌性、抗氧化性等抗逆能力，具有重要的应用价值。为提高米曲霉产曲酸能力，科研人员用同源重组基因敲除技术成功敲除了米曲霉3.042 菌株中的msn2基因，获得高产的g-5菌株。其部分机理如图1所示（bp表示碱基对）。

（1）构建基因敲除框需要的工具酶有__________，将基因敲除框导入米曲霉细胞常用的方法是__________。

答案：限制酶、DNA连接酶      钙离子转化法

解析：从图中可以看出在msn2两侧存在msn2L和msn2R基因，所以欲实现msn2基因的敲除，需要在pyrG基因两侧分别插入msn2L和msn2R片段，在这个过程中，需要用限制酶将基因切割，再用DNA连接酶将三个基因片段连接；米曲霉是微生物，常用钙离子转化法将外源基因转入微生物细胞。

（2）科研人员选取进行基因敲除操作后的3个菌落，分别提取其DNA，选择图中引物____________进行PCR扩增，电泳结果如图2 所示。根据1号菌落电泳结果可得出的结论是____________。为进一步验证3号菌落为目的菌落，需要选择图中引物__________重复上述操作。

答案：A和B       1号菌落没有实现基因敲除，含有米曲霉3.042基因组原始序列     C和D 

解析：从图中可以看出，引物C和引物D都不能将g-5基因组扩增完，所以为进行PCR扩增，需要选择引物A和B；1号菌落碱基对接近3000bp≈1024+1024+909，所以没有实现基因敲除，含有米曲霉3.042基因组原始序列；3号菌落大约含有3700bp的碱基对，引物C和D可以扩增pyrG，所以可以选择引物C和D重新扩增并电泳。

（3）米曲霉的曲酸产量与其对逆境的敏感性有关，tpsⅠ基因表达产物可以降低米曲霉对逆境的敏感性。推测tpsⅠ基因表达产物与曲酸合成的关系是 __________。为验证该推测，可采用的实验方法是___________，预期实验结果是 __________。

答案：msn2基因表达产物的缺乏，抑制了tpsI基因的表达，提高了米曲霉对逆境的敏感性，从而导致米曲霉产生更多的曲酸      敲除米曲霉的msn2基因，检测米曲霉的曲酸产量      曲酸产量增多

解析：tpsI基因表达产物可以降低米曲霉对逆境的敏感性，g-5菌落tpsI基因表达量明显降低，所以可以推测msn2基因敲除能使米曲霉产曲酸增多的机理是msn2基因表达产物的缺乏，抑制了tpsI基因的表达，提高了米曲霉对逆境的敏感性，从而导致米曲霉产生更多的曲酸；为验证该推测，可采用的实验方法是将米曲霉的msn2基因敲除，检测米曲霉的曲酸产量。预期msn2基因敲除，米曲霉的曲酸产量增多。

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