判断目的基因的接入方向

 

来源公众号：北庄生物

目的基因正反接的判断需通过分子生物学实验验证，最常用且有效的方法依次为：测序确认（金标准）、限制性酶切图谱分析、PCR扩增分析；辅助方法包括功能检测（如报告基因表达）。

1. 测序确认（金标准）

原理：通过Sanger测序直接读取重组质粒中插入片段的序列及方向，与设计的目的基因序列对比，明确是否存在反向插入。
      20世纪70年代Fred sanger 发明了双脱氧终止法对DNA进行测序，其原理如图：在4支试管中分别加入4种脱氧核苷三磷酸（dNTP）和1种双脱氧核苷三磷酸（ddNTP） ； ddN’TP可以与dNTP竞争核苷酸链延长位点，并终止DNA片段的延伸，在4支试管中DNA链将会分别在A、G、C、T位置终止，并形成不同长度的DNA片段，这些片段可被电泳分开并显示出来。下列说法中错误的是（　　）

A．这种测序方法需要引物和耐高温的 DNA聚合酶
B．电泳图谱中的箭头所指的DNA片段以鸟嘌呤结尾
C．测得未知 DNA的序列为5′-GATTCGAGCTGA- 3′
D．ddNTP 与dNTP竞争的延长位点是核苷酸链的3’端

答案C

2. 限制性酶切图谱分析

    原理：利用插入片段两端的限制酶位点，通过双酶切或单酶切释放插入片段，结合电泳条带大小判断方向。

应用：

    双酶切法：选择目的基因两端的不同限制酶（如EcoRⅠ和HindⅢ），对重组质粒进行双酶切，若切下的插入片段大小与预期一致，则方向正确；
    从图1酶切结果分析，图2中的目的基因（长度为20kb）插入方向正确的重组质粒序号和作出该判断所用的限制酶是（　　）

A．①，EcoRI和HindⅢ
B．①，BamHI
C．②，EcoRI和HindⅢ
D．②，EcoRI

答案A

    单酶切法：若载体和目的基因均含同一酶切位点（如BamHⅠ），单酶切后可产生不同长度的线性化质粒（正向连接与反向连接的片段大小不同），通过电泳区分。
     当目的基因和质粒都用Hind Ⅲ处理、连接后，目的基因可能正向插入载体，也可能反向插入载体，为判断目的基因的插入方向，可使用限制酶处理，并进行电泳检测（如图）。下列选项中能判断目的基因插入方向的限制酶是（       ）

注：EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ和Hind Ⅲ的识别序列、切割位点均不同，数字表示相邻两个限制酶切点之间的碱基对数（bp），质粒全长20000bp。

A．Hind Ⅲ
B．EcoR I
C．BamH I
D．EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ

答案B

3. PCR扩增分析

    原理：设计跨越插入位点的引物（一端与载体骨架互补，另一端与目的基因互补），通过PCR扩增产物的大小判断方向。

应用：

    引物设计：正向引物（F）结合载体多克隆位点上游，反向引物（R）结合目的基因3’端；若目的基因正向插入，PCR产物大小为“载体片段+目的基因长度”；若反向插入，则无法扩增出预期片段（或片段大小异常）；

注：多克隆位点：基因工程载体（如质粒、噬菌体载体等）上一段人工合成的、集中排列了多种不同限制内切酶单识别位点的 DNA 序列。
     当目的基因和载体用同一种限制酶处理，连接后目的基因可能正向插入载体，也可能反向插入载体，为判断目的基因的插入方向，可设计引物进行PCR后再结合电泳检测。图示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，其中目的基因的长度为300bp（bp：碱基对数）。下列叙述错误的是（       ）

A．PCR扩增的原理与生物体内DNA复制的原理相同
B．抗性基因作为标记基因，用于鉴别受体细胞中是否导入目的基因
C．选取引物甲、丙，扩增出450bp长度片段时，可以说明目的基因正接
D．选取引物甲、乙，扩增出400bp长度片段时，可以说明目的基因反接

答案C

4. 功能检测（辅助方法）

    原理：通过目的基因的表达产物（如蛋白质、报告基因）判断方向是否正确（反向插入通常无法正常表达）。

应用：

    若目的基因含报告基因（如GFP、荧光素酶），可通过荧光显微镜观察或化学发光检测，若正向插入则报告基因表达（有荧光/发光），反向插入则不表达；

    若目的基因编码功能蛋白（如酶），可通过酶活性测定（如Western blot检测蛋白表达），若正向插入则酶活性高，反向插入则无活性；

    示例：重组质粒中含RFP基因，正向插入时发红色荧光，反向插入则无荧光，可快速筛选正确克隆。
    CD163蛋白是PRRSV病毒感染家畜的受体。为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程，将红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因拼接在一起，使其表达成一条多肽。下图是基因表达载体的一部分，下列叙述错误的是（　　）

A．若该拼接基因在受体内成功表达，则可直观显示PRRSV病毒易感部位
B．该拼接过程需除去CD163基因中编码终止密码子的序列
C．基因表达载体中必须含有目的基因、启动子、终止子等
D．终止子的作用是使翻译在所需要的地方停下来

答案D

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