豚鼠胰腺腺泡细胞分泌蛋白形成过程

 

来源公众号：生命教育观察

问题的提出：“豚鼠胰腺腺泡细胞分泌蛋白形成过程”经典实验中，有些疑难问题的解决，如为什么用³H-亮氨酸、为什么用胰腺腺泡细胞等可以参见文章末的推荐阅读。下面说一说同行提出的一个问题，人教版教材对分泌蛋白的合成和运输（必修1第51页，如下所示）进行了修改，即”注射“修改为”培养液中培养“，修改的理论根据是什么？有没有必要修改？沪科技版和苏教版用的也是细胞中注射，显然未修改前的细胞中注射肯定是不符合操作的可行性，浙科版教材中用的是培养豚鼠胰腺腺泡细胞。

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上述经典实验的研究成果是由乔治・E・帕拉德（George E. Palade）负责完成，在1974 年获得了诺贝尔生理学或医学奖。他与阿尔伯特・克劳德（Albert Claude）、克里斯汀・德・迪夫（Christian de Duve）共同获奖，获奖理由是 “发现了细胞的结构与功能组织”，其中帕拉德的核心贡献包括通过同位素标记法揭示分泌蛋白的合成与运输路径，以及对核糖体、内质网等细胞超微结构的开创性研究。

一、经典实验背景

帕拉德团队分泌蛋白合成与运输实验（1960-1964 年）核心论文发表于《The Journal of Cell Biology》，是揭示分泌蛋白运输路径的经典实验。这个经典实验实际上包含体内注射和体外培养液培养两种互补的操作。采用³H-亮氨酸（分泌蛋白的必需氨基酸，胰腺腺泡细胞会主动摄取用于合成消化酶等分泌蛋白）脉冲追踪法，结合电子显微镜放射自显影技术。

显微放射自显影的基本实验步骤如下：首先用合适的放射性前体分子标记机体或细胞，根据实验的需要按标记的持续时分为持续标记和脉冲标记。标记后的组织与细胞可按常规方法制片，在暗室中向样品表面均匀的敷一层厚3~10μm的乳胶膜，然后再暗盒中曝光（或自显影）数天，再经自显影，定影后于显微镜下观察。细胞中银颗粒所在的部位即代表放射性同位素的标记部位。

该系列实验首次通过同位素标记与电镜自显影的结合，明确了分泌蛋白的完整运输路径：核糖体（粗面内质网附着）→粗面内质网→高尔基体→分泌囊泡→细胞外，证实了内质网、高尔基体在分泌蛋白加工与运输中的核心作用，为后续内膜系统的囊泡运输理论奠定了实验基础。

二、体内实验——体内脉冲标记

向豚鼠静脉注射³H-亮氨酸（非教材中所说的向豚鼠胰腺腺泡细胞中注射），控制注射后的时间（即“脉冲”时间），在不同时间点取胰腺腺泡细胞进行观察。通过时间梯度观察放射性信号的定位，明确了分泌蛋白的运输路径：

3min后：放射性颗粒主要集中于粗面内质网（RER）的核糖体附着区域，证明分泌蛋白的起始合成位点是粗面内质网。

17min后：放射性信号转移至高尔基体的扁平囊泡与小囊泡，提示蛋白从内质网运输至高尔基体进行加工、分拣。

117min后：放射性颗粒富集于靠近细胞膜的分泌囊泡（酶原颗粒），后续检测到标记物释放至细胞外的胰液中，证实分泌囊泡与细胞膜融合、释放蛋白的胞吐过程。

三、体外实验——体外追踪培养

为了更精准地控制实验条件（如加入抑制剂研究蛋白合成与运输的偶联关系），团队同时开展了体外实验（也有一说法是在第一阶段的基础上做体外实验，个人认为是独立的平行开展的互补实验，理由是通过体外可控条件，更精准地验证运输机制）。

将豚鼠胰腺组织切片置于含³H-亮氨酸的培养液中短期培养（脉冲标记），再转入无标记培养液继续追踪。这种体外培养的方法，验证了体内实验的结果，还能更直接地研究分泌蛋白运输的调控机制。

体外培养的胰腺腺泡细胞完全重现了 “粗面内质网→高尔基体→分泌囊泡→细胞外” 的运输路径，且通过“脉冲标记+追踪培养”，更精准地证明了蛋白运输的时间依赖性。

加入蛋白合成抑制剂（环己酰亚胺）后，新蛋白合成被阻断，但已进入内质网的蛋白仍能继续运输至高尔基体，表明蛋白合成与后续运输是可分离的过程。

直接观察到高尔基体中 “囊泡出芽-融合” 的动态过程，为“内膜系统的囊泡运输假说”提供了形态学证据。

四、典型试题

试题：1974年，诺贝尔生理学或医学奖颁给了三位细胞生物学家，分别是美国的克劳德、比利时的德迪夫和罗马尼亚的帕拉德。如图为他们的主要成就，回答下列问题：（注：[   ]中填图中标号）。

（1）要深入了解细胞的秘密，就必须将细胞内的组分分离出来。经过艰苦的努力，克劳德终于摸索出来采用不同的转速对破碎的细胞进行离心的方法，将细胞内的不同组分分开，即_______法。图3是用该方法进行的实验过程，沉淀物中不含DNA的是______试管。

（2）1949年德迪夫正在研究胰岛素对大鼠肝组织的作用时，一个偶然的现象使他困惑不解：有一种酸性水解酶，从肝组织分离出来的时候活性并不高，但是保存5天后，活性出人意料地大大提高了。他想这种酶一定存在于细胞内的某个“容器”中。他继续做了许多实验，结果证实了他的推测，这种酶被包在完整的膜内。这个“容器”是______（填细胞器），该细胞器的作用是______。

（3）帕拉德是克劳德的学生和助手，他改进了电子显微镜样品固定技术，并应用于动物细胞超微结构的研究，发现了核糖体和线粒体的结构。后来他与同事设计了利用同位素示踪技术研究蛋白质合成过程的实验，图2表示分泌蛋白合成、加工和分泌的过程，a、b、c分别表示的细胞器是______，该过程的研究也体现了细胞内的生物膜在______上有一定的联系。物质X的结构简式是______。在抗体合成与分泌的过程中，某些膜结构的面积会发生短暂性的变化，其中膜面积最终表现为减小的结构是图2中的[    ]______。

答案：（1）差速离心     丁    （2）溶酶体     能分解衰老、损伤的细胞器，吞噬并杀死侵入细胞的病毒或病菌     （3）核糖体、内质网、高尔基体     结构和功能      b     内质网

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