米尔斯坦和科勒制备单克隆抗体过程的几个问题思考

 

来源公众号：生命教育观察　作者：小强大生物

在高中生物教学中，米尔斯坦和科勒发明的单克隆抗体制备技术是一个重点内容。教材流程图看似简单，其实每一条线条背后都有大量的思维值得我们去挖掘。很多学生在实际操作和原理理解上，存在许多高中生容易忽略的细节和误区。

为什么骨髓瘤细胞必须是“次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷型”（HGPRT⁻）？

学生往往只记住了“选择培养基”，但不理解为什么骨髓瘤细胞要选这种特殊的突变株。这是为了配合HAT选择培养基的工作原理。HAT培养基含有次黄嘌呤（H）、氨基蝶呤（A）和胸腺嘧啶核苷（T）。氨基蝶呤会阻断DNA合成的“主要途径”。细胞要存活，必须通过“补救途径”合成DNA，这就需要HGPRT酶。如果骨髓瘤细胞是正常的（HGPRT⁺），它们在HAT培养基中也能存活，无法被筛选掉。只有使用HGPRT⁻的骨髓瘤细胞，它们既不能走主要途径（被阻断），又不能走补救途径（缺乏酶），所以未融合的骨髓瘤细胞和骨髓瘤-骨髓瘤融合细胞都会死亡。

第一次筛选（HAT培养基）得到的就是能分泌所需抗体的细胞吗？

有学生错误认为只要在HAT上长出来的细胞就是我们要的单克隆抗体生产者。HAT培养基只起到了“生存筛选”的作用，它只保证了长出来的细胞是杂交瘤细胞（存活下来了）。但是，小鼠脾脏里有成千上万种B细胞，每种B细胞针对的抗原表位都不同。融合后，长出来的杂交瘤细胞可能分泌的是针对抗原A的抗体，也可能是针对抗原B的抗体，甚至可能不分泌有效抗体。因此，必须进行第二次筛选（抗体检测），通常采用抗原-抗体杂交技术，找出那些能分泌特定抗原抗体的杂交瘤细胞。

为什么要进行“克隆化培养”？

有学生错误认为筛选出阳性孔后直接扩大培养即可。其实这是保证“单克隆”。一个阳性孔里可能混有多种杂交瘤细胞（虽然都是阳性，但可能分泌的抗体细微结构不同）。只有通过有限稀释法，将细胞稀释到每孔0.5-1个细胞，确保长出来的细胞群是由单个细胞分裂而来的，才能保证所有细胞遗传背景一致，分泌的抗体才是真正的“单克隆抗体”。

体外培养和体内培养（小鼠腹腔）有什么区别？

有学生错误认为两种方式得到的抗体纯度和浓度一样。其实这里各有优劣。体外培养条件可控，产物纯度相对较高，无动物血清污染风险，但成本高，抗体浓度较低。体内培养在小鼠腹腔内，杂交瘤细胞会形成肿瘤并产生大量腹水，腹水中抗体浓度极高（可达mg/mL级别），成本低，产量大，但后续纯化步骤较繁琐，且含有小鼠自身的其他蛋白。

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