什么是实时荧光定量PCR实验中的阈值？

 

来源公众号：生物奇迹

阈值的定义

在实时荧光定量PCR 实验中，阈值是指在荧光信号的对数增长期设定的一个荧光强度值。它是一个人为设定的固定数值，用于标准化荧光信号的检测和分析。这个数值的设定是为了确定每个样本在 PCR 扩增过程中，荧光信号达到可被认为具有显著意义的水平时所对应的循环数，即 Ct 值（Cycle threshold）。

阈值设定的重要性

01 定量分析基础

阈值的设定是进行核酸定量分析的关键步骤。通过设定阈值，可以准确地比较不同样本之间的 Ct 值。由于起始模板 DNA 量与 Ct 值呈反比关系，在相同的反应条件下，利用已知浓度的标准品制作标准曲线（横坐标为模板 DNA 浓度的对数，纵坐标为 Ct 值）后，就可以根据样本的 Ct 值来定量计算样本中起始模板 DNA 的浓度。

02 标准化检测

不同的样本、实验批次或者仪器之间可能存在荧光背景信号的差异。阈值可以帮助消除这些差异对结果判断的影响。它使得实验人员能够以一个统一的标准来衡量每个样本的扩增情况，从而更准确地判断样本中是否含有目标核酸以及核酸的相对或绝对含量。

如何设定阈值

01 选择对数增长期

理想的阈值应该设定在荧光信号的对数增长期。在 PCR 反应初期，荧光信号较弱且不稳定，主要是因为起始模板量少，扩增产物也少；而在反应后期，随着反应底物的消耗、酶活性的降低等因素，荧光信号进入平台期，增长缓慢甚至停止。对数增长期是荧光信号增长最快且呈线性增长的阶段，这个阶段的荧光信号能够真实地反映 PCR 产物的指数增长情况。

02 考虑实验目的和样本差异

在实际操作中，阈值的设定还需要考虑实验目的和样本的具体情况。一般来说，阈值应该高于背景荧光信号，但不能过高，以免错过一些低表达或者低拷贝数的目标核酸。同时，对于不同类型的实验（如基因表达分析、病原体检测等）和不同的样本（如细胞样本、组织样本、临床样本等），可能需要根据经验和预实验来调整阈值的设定，以确保结果的准确性和可靠性。有些荧光定量 PCR 仪器的软件会提供自动设置阈值的功能，不过手动调整阈值仍然是必要的，尤其是在处理复杂样本或者进行高精度定量分析时。

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