表观遗传学：siRNA和RNAi

来源公众号：一只蜉蝣的日常

siRNA的产生

外源性来源

这是 siRNA 最常见的来源，也是实验室科研中最常用的手段。

内源性来源

细胞内也会产生天然的 siRNA（称为 endo-siRNA-主要存在于卵子细胞和早期胚胎中）

病毒复制： 许多病毒（如轮状病毒）的遗传物质本身就是双链 RNA，在宿主细胞内复制时，会形成长链双链 RNA（dsRNA）；有些单链 RNA 病毒，在宿主细胞内复制时，也会产生一个互补链，从而形成暂时的 dsRNA 状态。
基因组转录（如转座子）：产生 endo-siRNA 或 shRNA-like 结构。

总结｜siRNA产生机制

1、触发

（1)dsRNA(双链RNA）

由两条完全独立的互补 RNA 单链通过碱基配对结合而成。

(2)shRNA（短发卡 RNA）

一根单链RNA，但序列设计成了“互补—回路—互补”的模式。这根单链会像发卡一样折叠，中间由一个不配对的环（Loop）连接，形成类似发夹的结构。

2、加工

一个叫Dicer的“剪切机”将长链RNA切成大约21个碱基对的双链RNA duplex的小片段，这就是siRNA。（未来与mRNA互补的链是引导链，另外一条是随从链）

3、组装

双链siRNA被装载到AGO2等蛋白上，形成前体RISC（RNA诱导的沉默复合体），随后，双链解开，随从链被丢弃，引导链被保留，形成成熟的、有活性的RISC。

备注：1、AGO2蛋白在哺乳动物中，四种AGO蛋白（AGO1-4）中，只有AGO2具有核酸内切酶活性，是切割mRNA的关键执行者。2、AGO2蛋白会选择双链中一条热力学稳定性较低的链作为成熟的引导链，另一条随从链则被降解并排出

4、执行

RISC复合体在细胞中巡逻，siRNA像“导航”一样，通过碱基配对，精准找到与之完全匹配的靶标mRNA（基因的“信使”）。然后，AGO2蛋白像剪刀一样将mRNA剪断、降解，从而阻止这个基因生产蛋白质，实现基因沉默。

RNAi的调控机制

RNA 干扰(RNA interference, RNAi)是真核生物中由小干扰 RNA( siRNA)所介导的基因沉默现象。

RNAi 在细胞质中沉默基因表达的手段主要是通过 siRNA-RISC 介导的核酸内切酶作用降解 mRNA。

01 siRNA介导的基因表达转录水平调控机制

RNAi机制不仅能作用于细胞质中的成熟mRNA，还能进入细胞核，在更上游的环节（染色质水平和转录过程）调控基因表达，这被称为核内RNAi。

介导表观遗传修饰（染色质沉默）：
- 机制：细胞核内的siRNA（或与其类似的途径）可以引导AGO蛋白及相关复合体定位到染色质上的同源DNA区域，进而招募组蛋白修饰酶或DNA甲基化酶，改变局部染色质状态。
- 组蛋白修饰：如诱导组蛋白H3第9位赖氨酸三甲基化或第27位赖氨酸三甲基化。这些是异染色质的标志，能抑制基因转录。DNA甲基化：在植物中尤为突出，存在RNA指导的DNA甲基化途径。

生物学功能：在酵母、植物、线虫等模式生物中，该机制对于着丝粒、端粒等异染色质区域的形成和维持、沉默转座子、以及发育基因的时序性调控至关重要。在哺乳动物中，核内RNAi的作用仍在深入研究。
影响转录过程本身：
- 抑制转录延伸：在线虫等生物中，核内siRNA/AGO复合体（如NRDE-3）可结合到正在转录的pre-mRNA上，进而招募蛋白导致RNA聚合酶II发生暂停或提前终止，从而阻碍转录的完成。
- 双向调控：某些AGO蛋白（如线虫的CSR-1）结合的小RNA反而能促进靶标基因的转录，其机制尚不完全清楚，提示了核内小RNA调控的复杂性。
参与其他核内过程：
- 调控RNA选择性剪接：在哺乳动物细胞中，siRNA或dsRNA可以将AGO蛋白招募到特定pre-mRNA上，改变其剪接方式，从而产生不同的蛋白质亚型。这一过程不依赖于mRNA的降解。
- 维持染色体稳定性：RNAi组分参与染色体配对和分离。例如，在裂殖酵母和线虫中，RNAi机器对于着丝粒功能和有丝分裂/减数分裂中染色体的正确分离是必需的。

02 RNAi引起的毒副作用

siRNA的脱靶效应

siRNA通过与靶基因RNA完全互补配对来实现特异性沉默（称为“靶上效应”）。然而，如果siRNA与非靶基因的RNA发生部分互补配对（特别是其第2至第7位碱基与靶RNA互补），就会以类似于microRNA的机制，抑制该非靶基因mRNA的翻译并加速其降解。这种非特异性抑制靶基因以外其他基因表达的现象，就称为脱靶效应。
后果：
- 功能误读：在科学研究中，siRNA可能会影响几十甚至几百个基因的表达，导致对靶基因功能的错误解读，产生假阳性结果。
- 多重来源：
1. 引导链脱靶：被RISC复合体保留的siRNA引导链可能与非靶mRNA部分配对。
2. 随从链脱靶：在RISC装载过程中，本应被丢弃降解的随从链也可能被保留，并产生自身的脱靶效应。
3. 蛋白依赖差异：在哺乳动物中，AGO2是唯一具有切割活性的AGO蛋白，能高效介导完全互补的靶向切割。但AGO1、AGO3、AGO4也能结合siRNA，它们主要介导部分互补配对引发的翻译抑制，其介导脱靶效应的效率甚至可能比AGO2更高。
特殊风险：许多基因存在天然的反义链转录本。当使用siRNA研究此类基因时，其引导链沉默正义链RNA，而其随从链可能沉默反义链RNA，导致实验假象。

siRNA对内源miRNA的竞争抑制

不论是化学合成的siRNA，还是由载体表达的shRNA，其最终发挥作用都需要占用细胞内的核心加工机器和效应蛋白，这与内源miRNA的加工和功能通路存在直接竞争。
竞争资源：
- 加工因子：载体表达的shRNA会与内源miRNA前体竞争Drosha/DGCR8复合体、核质转运蛋白Exportin-5以及Dicer酶。
- 效应蛋白：所有进入细胞的siRNA（无论是外源导入还是内源产生）都会与内源miRNA竞争有限的AGO蛋白，以装载形成RISC复合体。
后果：这种竞争会导致细胞内源miRNA的加工和功能普遍受到抑制，引起其靶基因表达水平异常上调，破坏细胞正常的调控网络，从而导致细胞毒性。文档明确指出，在小鼠肝脏中长期高表达shRNA可因竞争Exportin-5和AGO2而导致肝损伤甚至死亡。