徐宏伟等：关于光合色素分离实验相关疑问的实验探究

 

来源公众号：华东师范大学生物学教学杂志

《普通高中生物学课程标准(2017年版2020年修订)》提炼了普通高中生物学学科核心素养，其中就包括科学思维和科学探究，实验教学是促成学生达成生物学学科核心素养的重要支撑。

光合色素的提取和分离实验是浙科版《生物学·必修1·分子与细胞》第3章第5节中的活动，该实验的目的是观察叶绿体中的主要色素。因叶绿体中的光合色素是脂溶性的，用95%的乙醇可提取，提取的光合色素可用纸层析法对其进行分离。学生操作的光合色素提取和分离实验结果如图1，叶绿素a条带最宽，叶绿素b条带和叶黄素条带次之，胡萝卜素条带最窄。学生结合叶绿体中各色素的大体含量，提出假说：滤纸上色素带的宽度可用来判断色素的含量，即色素带的宽度与色素含量呈正相关。这个假说是否正确？是一个值得进一步探究的问题，可以通过对层析的概念、光合色素分离的基本原理的理解，根据学生的假说，设计两组实验来检验该假说。

1 层析的基本概念

层析(Chromatography)技术是根据物质的理化性质，如吸附力、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、分配系数等的差异而建立的分离、分析方法。所有的层析系统都由两个相组成：一是固定相，它可以是固体、液体或一种液体和一种固体的混合物(液体性质的物质固定于固体物质上)：另一是流动相，即可以流动的物质，如水、气体或各种可溶性媒介。当待分离的混合物随溶媒(流动相)通过固定相时，由于各组份的理化性质存在差异，与两相发生相互作用(吸附、溶解、结合等)的能力不同，在两相中的分配系数(含量对比)不同。因此，随着溶媒向前移动时，各组份不断地在两相中进行再分配，从而使各组分以不同速度移动而分离。

2 分离光合色素的基本原理

叶绿体中含有叶绿素(叶绿素a和b)和类胡萝卜素(主要为胡萝卜素和叶黄素)两大类。这两类色素均不溶于水而溶于有机溶剂，故可用酒精或丙酮等有机溶剂提取。提取液可用层析的原理加以分离。因叶绿体色素在不同溶剂中的溶解度不同，当有机溶剂不断从介质上流过，由于叶绿体色素中各种成份在两相中(即流动相——有机溶剂、固定相——如滤纸纤维中的水分)具有不同的分配系数，所以它们的移动速度不同，经过一段时间后，可将各种色素分开。

3 色素带的宽度与色素含量呈正相关假说的实验检验

3.1 改变纸层析实验点样方式和层析液的配比并增加层析时间

    纸层析是一种常见的层析方法。它是以滤纸(载体)上吸附的水为固定相，一般以有机溶剂为流动相。操作时，将样品混合物加在纸的一端，使流动相经此流过并带动样品移动，各组分因在两相中的分配系数不同而逐渐分离于纸上不同部位。实验材料与步骤：以新鲜的菠菜叶来提取色素，参照教材实验步骤进行。修正部分：沿滤纸的下边缘中点减去两角，使滤纸下部呈三角形；点样由滤液细线改成点状点样，点样在滤纸正中间；层析液，石油醚4.5mL+90%丙酮0.5mL。层析时间：15-20分钟。实验结果如图2所示。

图2结果说明了在改变层析液的配比、点样方式、增加层析时间的情况下，叶绿素b的条带最宽，而不是叶绿素a所在的条带最宽。实验1的结果否定了假说。

3.2 利用聚酰胺薄膜为层析介质乙醇为流动相

   聚酰胺是由酰胺聚合而成的高分子物质，既有亲水基团又有亲脂基团，乙醇与固定相(聚酰胺薄膜)都具有极性。在毛细拉力作用下，层析液能不断地在聚酰胺薄膜上流动，由于各组分在层析液中的溶解度及其与聚酰胺形成氢键能力的大小不同，决定了它们在层析过程中迁移的速度差异，从而实现分离。类胡萝卜素不会和酰胺平面发生作用，而叶绿素亲水头部会和酰胺平面发生相互吸引作用所以类胡萝卜素条带跑得快在前面。对于类胡萝卜素中的两类色素，由于叶黄素的两个羟基，和流动相的乙醇作用更强，而聚酰胺薄膜滤纸对叶黄素的吸附力最小，所以叶黄素的扩散速度最快。对于叶绿素a和叶绿素b，叶绿素b有一个取代基是甲醛基，而叶绿素a是甲基，由于甲醛基团和酰胺平面通过氢键相互吸引，产生较大阻力，因而叶绿素a比叶绿素b移动得快。

实验材料：新鲜的菠菜叶；实验步骤：参照教材实验步骤进行。修正部分：用聚酰胺薄膜为层析介质，层析液为无水乙醇。实验结果如图3所示。

由结果可知，换成聚酰胺薄膜层析，由于聚酰胺薄膜滤纸对各色素的吸附力不同，其色素带从上到下的分布顺序与纸层析法不完全相同、色素带的宽度也差异较大，其中叶黄素与叶绿素a的色素带的宽度较宽，叶绿素b与胡萝卜素的色素带的宽度较窄。实验2的结果同样否定了假说。

4 小结与反思

通过改变层析液物质的配比、点样方式、层析时间和改变层析液的种类与层析的介质这两组实验，否定了学生提出的色素带的宽度与色素含量呈正相关的假说。说明教材的光合色素分离实验中，色素带的宽度与含量没有必然相关性。进一步分析可知层析液的种类、层析液物质的配比、点样方式、层析时间、层析的介质等都会影响色素带的宽度及色素带的分布。

在各版本教材中，只有上海科学技术出版社的高中生物学必修1教材中对叶绿素含量有定量测定，即利用叶绿素a和叶绿素b的吸收峰值不同，利用分光光度计测定吸光度，然后代入公式进行计算[4]。

教师在教学过程中应明确光合色素分离实验是一个定性实验而非定量实验，通过设计实验验证让学生知晓，仅仅因为两个事件相关并不意味着一个事件导致了另一个事件，区分相关性和因果关系是非常重要的。这对于培养学生的科学思维具有重要的意义。

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