PCR扩增反应为什么要用到两种引物？

 

来源公众号：bioinfotec

在 PCR 反应中，引物是决定扩增目标的“指挥官”。引物是一段短小的单链 DNA，它会匹配我们想要扩增序列的起点和终点。

只要设计好一对引物，PCR 反应就只会“放大”这对引物之间的那段 DNA。

通常我们设计一对引物：一个是 forward primer（正向引物），另一个是 reverse primer（反向引物），它们分别结合在互补的两条链上，像是为 DNA 片段“打上书签”。DNA 聚合酶就会以它们为起点，只复制它们之间的那一小段序列——实现特异性扩增。

正向引物和反向引物

我们知道 DNA 是双链的，两条链缠绕在一起形成螺旋结构。但当我们把它加热到 94–95°C 左右时，两条链之间的氢键就会断裂，DNA 会“解链”变成两条单链。

实际上，我们常常把感兴趣的那一条链叫作上链（也叫正链，编码链），因为它通常包含目标基因的序列。从方向上来说，上链是从左边的 5′端到右边的 3′端。而下链（即负链，模板链），则正好相反，它是从右边的 5′端到左边的 3′端。

在 PCR 中，我们需要一对引物来告诉 DNA 聚合酶“从哪里开始复制”。因为 DNA 被加热后变成两条单链，我们可以分别以这两条链为模板进行复制。

如果我们以下链为模板（也就是从 3′ → 5′ 方向读取），聚合酶会按 5′ → 3′ 方向复制出一条新链，新链会与上链一致。那么起始的那条引物就是正向引物（forward primer），它结合在下链上，方向与上链一致。

反过来，如果我们以上链为模板，聚合酶也要按 5′ → 3′ 方向合成新链，这条新链与上链互补，方向与上链相反。这时候的引物就是反向引物（reverse primer），它结合在上链上，方向与下链一致。

如果只用一个引物会发生什么？

如果我们只使用一个引物，比如只用了正向引物，PCR 会发生一些不理想的情况。

首先，每一轮扩增只能合成一条链，也就是所谓的“互补链”，因为没有提供第二个引物去合成该“互补链”的互补链。这意味着我们获得的只是单链 DNA，不能在下一轮 PCR 中继续作为模板进行双链扩增。

更关键的是，只使用一个引物时，PCR 的扩增是线性的而不是指数型的。也就是说，每一轮扩增只能在原始模板上合成一次新链，而不会形成可以进一步扩增的新模板。例如，我们从 10 个模板分子开始，下一轮变成 20、再下一轮变成 30……增长是逐步的。而使用两个引物时，每一轮新合成的双链 DNA 都可以成为下轮的模板，因此扩增是成倍增长的，如 10、20、40、80……效率远远高于线性扩增。

此外，单引物扩增还有一个问题：无法精确控制扩增片段的长度。DNA 聚合酶从引物起始点开始复制，会一直延伸到模板的末端或直到反应时间结束。这可能会导致扩增产物很长、不确定，甚至是整个质粒或大片段 DNA。而使用两种引物时，引物本身界定了起点和终点，因此产物的长度是可以被精准控制的。

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