单克隆抗体制备值得关注的3个问题

 

来源公众号：生命教育观察

1.与骨髓瘤细胞融合的B淋巴细胞为什么有多种？

每个抗原都有一些不同的抗原决定簇，每种抗原决定簇都会刺激不同的B淋巴细胞产生一种针对它的抗体。这些由同一抗原诱导而产生的针对多个抗原决定簇的抗体，称为多克隆抗体。理论上用于和骨髓瘤细胞融合的细胞就是这些B淋巴细胞，即过程图中的“产生特定抗体的B淋巴细胞”。但实际操作时，选用的是从脾中分离的细胞，因为脾中有很多种细胞，包括B淋巴细胞、T淋巴细胞及巨噬细胞、树突状细胞等。这里就包括特定抗原刺激产生的能产生特定抗体的B淋巴细胞，还有其他抗原刺激产生的B淋巴细胞。分离的脾细胞中所含对抗原具有特异性的B淋巴细胞较少，即便是先用相应的抗原去筛选，选出的也是多种B淋巴细胞（针对抗原上的多种抗原决定簇），所以融合后还需要再次筛选。

2.单抗制备所用的B细胞是浆细胞吗？

哺乳动物B细胞的发育阶段：祖B细胞→前B细胞→未成熟B细胞→成熟B细胞→活化B细胞→浆细胞。

 用于单抗制备的是浆细胞吗？浆细胞不适用于细胞融合。有研究证实，小鼠注射抗原后7～8d产生抗体达到高峰，也就是7～8d后浆细胞产生达到高峰，但是取此时的细胞和骨髓瘤细胞融合效率很低；且浆细胞分泌抗体的能力强寿命通常只有3-5天，不利用杂交瘤细胞的融合。若取免疫后3d的细胞，则融合的效率最高，而此时的B细胞正处于从成熟B细胞向浆细胞分化的时期，也就是活化B细胞时期。所以，用于细胞融合的是接受过抗原刺激的活化B细胞。

3.单克隆抗体制备需要几次筛选？

哺乳动物细胞中合成DNA的途径有两条，一条是从头合成途径(de novo synthesis pathway,简称D途径)，该途径是从最简单的起始物(如核苷酸)开始进行生化合成的。在D途径中,酸及其衍生物是必不可少的，它们参与嘌呤环和嘧啶甲基的合成。HAT培养基中加人的氨基蝶呤是叶酸的拮抗剂，因此它可以阻断细胞利用D途径合成DNA。另一条是补救途径(salvage pathway，简称S途径)，该途径需要次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase，简称HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(thymidinekinase，简称TK)的参与，这两种酶可以催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷分别产生肌苷酸和胸腺嘧啶脱氧核苷酸，它们可以用来合成DNA。

骨髓瘤细胞是经过人工筛选的基因缺陷型细胞，缺乏HGPRT和TK。当它处于HAT培养基中时，它合成DNA的D途径被氨基蝶呤阻断；同时，它由于缺乏HGPRT和TK，所以不能利用S途径合成DNA，会很快死亡。而杂交瘤细胞从B淋巴细胞中获得了HGPRT和TK，可以利用补充在培养基中的次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷经过S途径来合成DNA，这样在HAT培养基中它可以生存并增殖。

第一次筛选：缺陷型骨髓瘤细胞

为了能够有效筛选杂交瘤细胞，需要依照上述知识将骨髓瘤细胞筛选为缺陷型细胞。通过诱变出现次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷型（HGPRT^–）或胸苷激酶缺陷型（TK^–）骨髓瘤细胞，并经过相关毒性培养基筛选出的HGPRT^–或TK^–骨髓瘤细胞。

第二次筛选：杂交瘤细胞

在小鼠脾脏中分离的B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞混合细胞悬液中，经融合后细胞将以多种形式出现：未融合B淋巴细胞、未融合骨髓瘤细胞、B淋巴细胞与B淋巴细胞融合的细胞、骨髓瘤细胞与骨髓瘤细胞融合的细胞、杂交瘤细胞以及细胞的多聚体形式等。正常的B淋巴细胞在培养基中仅能存活5～7天，无需特别筛选，细胞的多聚体形式也容易死去；未融合的骨髓瘤细胞则需要筛选去除。

筛选用的培养基是HAT选择培养基，该培养基有三种关键成分：次黄嘌呤（H）、氨基蝶呤（A）和胸腺嘧啶核苷（T）。氨基蝶呤是叶酸的拮抗剂，可阻断骨髓瘤细胞利用从头合成途径合成DNA，所以融合所用的瘤细胞及瘤细胞与瘤细胞融合的细胞不能在该培养基中生长。只有B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合的细胞具有亲代双方的遗传性能，才可在HAT培养基中长期存活与繁殖。

第三次筛选：能分泌特定抗体的杂交瘤细胞

由于脾脏中多种B淋巴细胞的存在，所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某一预定抗原决定簇的特异性杂交瘤细胞，才能制备单一性抗体。

筛选方法（人教选择性必修3第49页）：用96孔板培养来筛选杂交瘤细胞（每个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞），然后进行专一性抗体阳性检测。而抗体检测用酶联免疫吸附实验（ELISA）法、放射免疫测定（RIA）、免疫荧光试验、间接血凝试验等方法。

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