生物老师划重点：2024天津高考基因工程压轴题，讲明同源重组敲除基因与PCR电泳鉴定

 

来源公众号：师者解忧馆

很多同学一看到基因敲除、同源重组、PCR电泳这些词凑在一起，就觉得头皮发麻。2024年天津高考压轴题，就是把金黄色葡萄球菌的抗药性研究、基因敲除技术、质粒构建和PCR鉴定这几个考点串在了一起。今天我们就以这道题为模板，把每个空背后的原理掰开揉碎讲清楚。

一、题目速览

（2024·天津）金黄色葡萄球菌（简称Sa）是人体重要致病细菌、不规范使用抗生素易出现多重抗药性Sa。

（1）Sa产生抗药性可遗传变异的来源有______（至少答出2点）。

（2）推测Sa产生头孢霉素抗性与其R基因有关。为验证该推测，以图1中R基因的上、下游片段和质粒1构建质粒2，然后通过同源重组（质粒2中的上、下游片段分别与Sa基因组中R基因上、下游片段配对，并发生交换）敲除Sa的R基因。

①根据图1信息，简述质粒2的构建过程（需包含所选引物和限制酶）：______，然后回收上、下游片段，再与SacII酶切质粒1所得大片段连接，获得质粒2。

②用质粒2转化临床分离的具有头孢霉素抗性、对氯霉素敏感的Sa，然后涂布在含______的平板上，经培养获得含质粒2的Sa单菌落。

③将②获得的单菌落多次传代以增加同源重组敲除R基因的几率，随后稀释涂布在含______的平板上，筛选并获得不再含有质粒2的菌落。从这些菌落分别挑取少许菌体，依次接种到含____________的平板上，若无法增殖，则对应菌落中细菌的R基因疑似被敲除。

④以③获得的菌株基因组为模板，采用不同引物组合进行PCR扩增，电泳检测结果如图2，表明R基因已被敲除的是______。

二、第(1)小题：抗药性的“家族图谱”

问题：金黄色葡萄球菌产生抗药性的变异来源有哪些？

答案：基因突变、基因重组、表观遗传等

解析： 金黄色葡萄球菌是原核生物，没有真正的细胞核，也没有染色体。但它依然可以产生可遗传的变异。

第一，基因突变。这是最根本的变异来源。DNA复制时出现错误，或者受到外界因素影响，基因序列就变了。

第二，基因重组。虽然原核生物没有减数分裂，但可以通过转化、接合等方式，从其他细菌那里“借”来抗性基因。比如，肺炎链球菌的转化实验就是一个典型例子。

第三，表观遗传。基因的序列没有变，但基因的表达模式发生了可遗传的改变。比如，DNA甲基化就可能导致基因“沉默”。这是课本新增的内容，也是高考的热点。

三、第(2)小题①：构建“基因敲除工具”——质粒2

问题：如何构建质粒2？

答案：采用引物1和4进行PCR扩增（或采用引物1和3、引物2和4分别进行PCR扩增），用SacⅡ和EcoRⅠ对PCR产物进行酶切。

解析： 这是整道题最考验逻辑的地方。我们一步一步推理。

第一步：扩增出目标片段。 我们需要获得“上游片段”、“R基因”和“下游片段”这一整段DNA。看图1，引物1和4分别位于上游片段的左端和下游片段的右端。所以，用引物1和4进行PCR，就能完美地扩出整段序列。

第二步：切掉中间的R基因。 我们想要的是“上游片段”和“下游片段”，中间那个R基因要扔掉。看图1，上游片段和下游片段上各有一个EcoRⅠ酶切位点。所以，用SacⅡ和EcoRⅠ两种限制酶对PCR产物进行切割。这样就能把整段DNA切成三块：上游片段、R基因、下游片段。然后，我们只回收上游和下游这两个片段。

第三步：连接。 把回收的上游和下游片段，与用SacⅡ酶切后的质粒1大片段连接起来。这样就得到了质粒2。

一句总结：先用PCR扩出长片段，再用限制酶切掉中间不需要的部分，最后把剩下有用的片段连到质粒上。

补充：这个小题目要求利用基因敲除的方法，去除含有头孢霉素抗性的金黄色葡萄球菌中的头孢霉素抗性基因。这里涉及到基因敲除的概念：所谓基因敲除，就是其利用的原理是同源重组。所谓同源重组，是指被敲除的基因与导入的外源基因存在同源部分。这些同源部分会发生类似减数分裂中同源染色体配对的现象。并通过双交换，将需要敲除的基因替换下来。具体过程可如下图表示：

图中黑色线条代表含有抗性基因的DNA片段。绿色单片段表示不含抗性基因的DNA片段。虽然绿色片段不含抗性基因，但含有原有基因的上游和下游片段。在联会配对过程中，含有抗性基因的DNA片段会形成一个突环。由于该过程类似于联会且发生交叉互换，经过一次双交换后，抗性基因从原有片段中被替换下来。原本的DNA分子上仅保留由绿色片段组成的上游和下游DNA片段，至此，抗性基因完成替换 。题目给出了一个图。图中展示了金黄色葡萄球菌的部分基因组。其中含有抗性基因R基因。需要将这个含有R基因的部分基因组，改造成用于敲除目的基因的工具。如图:

四、第(2)小题②③：筛选的“三部曲”

这道题的筛选过程有三个步骤，每一步都有自己的目的。

第②题：如何筛选含有质粒2的细菌？

答案：氯霉素（或氯霉素+头孢霉素）

解析： 看图1，质粒2上有一个氯霉素抗性基因。所以，在培养基里加入氯霉素，只有成功导入了质粒2的细菌才能活下来。另外，原始的Sa菌株本身就具有头孢霉素抗性。所以，在培养基中同时加入氯霉素和头孢霉素，也可以达到筛选目的，还能进一步确保菌株的纯净。

第③题第一空：如何丢弃质粒2？

答案：脱水四环素

解析： 质粒2上有一个特殊的“自杀基因”——Y基因。这个基因可以被脱水四环素诱导表达，导致细菌死亡。在传代培养后，将细菌涂布在含脱水四环素的平板上。那些还带着质粒2的细菌，就会被杀死。活下来的，就是不再含有质粒2的菌落。

第③题第二空：如何验证R基因被敲除？

答案：头孢霉素

解析： 这一步的逻辑很简单。如果R基因被成功敲除了，细菌就失去了对头孢霉素的抗性。所以，把挑取的菌体接种到含头孢霉素的平板上。如果细菌无法生长，就说明它没有抗性了，R基因很可能被敲除了。

五、第(2)小题④：PCR电泳的“侦探破案”

问题：哪一组引物组合的PCR结果能证明R基因已被敲除？

答案：D（引物1和4）

解析： 这题考的是PCR的电泳图谱判断。

先看其他引物组合（A、B、C）： 引物2和3位于R基因的两侧。A组用了引物1和3，B组用了引物2和4，C组用了引物2和3。只要R基因还在，这些引物组合就能扩增出包含R基因的大片段。如果R基因被敲除了，扩增就会失败，或者产物是其他片段。但根据图2，A、B、C三组都有出现清晰的条带，说明R基因还存在。

再看D组： 用的是引物1和4。这两个引物分别位于上游片段和下游片段上。如果R基因被敲除了，原本被R基因隔开的上游和下游片段就“首尾相接”了。用引物1和4去扩增，能得到的产物长度大约是“上游片段0.7kb + 下游片段1.2kb = 1.9kb”。图2中，D组的电泳结果正好出现了一个清晰的条带，位置也符合1.9kb左右。这证明R基因确实被切掉了，上游和下游片段直接连在了一起。一句话总结：用引物1和4扩增，能产生一个约1.9kb片段的，就证明R基因已被敲除。

六、知识点总结

序号	关键结论
1	原核生物抗药性变异来源包括基因突变、基因重组和表观遗传。
2	同源重组技术利用上、下游同源序列，替换掉目标基因。
3	质粒构建过程：PCR扩增 → 限制酶切割 → 回收目的片段 → 连接。
4	氯霉素抗性基因是质粒2上的正筛选标记。
5	Y基因（被脱水四环素诱导） 是质粒2上的负筛选标记，用于消除质粒。
6	头孢霉素用于检验R基因是否被敲除（无抗性则为敲除成功）。
7	PCR引物设计：引物1和4扩增出的片段长度，可判断R基因是否存在。
8	电泳只能看长度，无法确定碱基序列。测序才能判断序列是否相同。

这道天津高考题，情境新、步骤多，但核心原理非常清晰。把同源重组“以好换劣”的逻辑、质粒构建的“切-连”步骤以及PCR鉴定“看长度”的思路搞懂了，再遇到类似的基因敲除题，你就能轻松拿下。收藏起来，考前翻一翻，你也能成为解题高手！

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