菌种的制备原理与方法

 

来源公众号：生物工程圈

　众所周知，微生物在自然界的分布极其广泛，不同环境条件下生长的微生物也相应有着不同的代谢类型和独特的生理特性。并不是所有的微生物都能用于工业生产。能够用于工业生产的微生物菌种，要具有以下特性:

   具备以上条件的菌株，才能保证发酵产品的产量和质量，这是发酵工业的最大目的和最低要求。对于某些发酵过程，还需要菌株具有一些其他的特性，包括对极端环境的耐受能力强、安全无毒、环境污染少等。

菌种的制备原理与方法

    一般来说，工业微生物可以从以下几个途径获得:

1、向菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需菌株;

2、由自然界采集样品，从中进行分离筛选;

3、从一些发酵制品中分离目的菌株。

以下将着重介绍从自然界中分离筛选出目的菌株的一般步骤和方法。

土壤由于具备了微生物所需的营养、空气和水分，是微生物最集中的地方。从土壤中几乎可以分离到任何所需的菌株，空气和水中的微生物也都来源于土壤，所以土壤样品往往是首选的采集目标。各种微生物由于生理特性不同，在土壤中的分布也随着地理条件、养分、水分、土质、季节而有很大的变化。因此，在分离菌株前要根据分离筛选的目的，到相应的环境和地区去采集样品。具体可参考的指标有:土壤有机质含量和通气状况、土壤酸碱度和植被状况、地理条件、季节条件等。另外，还可根据微生物的营养类型和生理特征来采样。例如要筛选高温酶生产菌时，通常可以到温度较高的南方或温泉、火山爆发处采集样品。

      富集培养是在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基，创造有利的生长条件，使目的微生物在最适的环境下迅速地生长繁殖，由原来自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种，以利于分离到所需的菌种。一般可从以下几个方面加以考虑

(1)控制培养基营养成分 微生物的代谢类型十分丰富，其分布状态随环境条件的不同而异。如果环境中含有较多某种物质，则其中能分解利用该物质的微生物也较多。因此，在分离该类菌株之前，可在增殖培养基中人为加入相应的底物作为唯一碳源或氮源，那些能分解利用这些底物的菌株因得到充足的营养而迅速繁殖，其他微生物则由于不能分解这些物质，生长会受到抑制。

(2)控制培养条件 在筛选某些微生物时，可以通过它们对pH、温度和通气量等条件的特殊要求来控制培养，达到有效的分离目的。如细菌、放线菌的生长繁殖一般要求偏碱(pH7.0~7.5)的环境，而霉菌和酵母要求偏酸(pH4.5~6.0)的环境。

(3)抑制不需要的菌类 在分离筛选的过程中，可通过高温、高压、加入抗生素等方法来减少非目的微生物的数量，从而使目的微生物的比例增加。例如，在土壤中分离芽孢杆菌时，由于芽孢具有耐高温特性，100°C很难将其杀死。因此，可先将土样在80°C中加热30min左右，杀死不产芽孢的微生物。在筛选霉菌和酵母时，通常可在培养基中加入氨苄西林或卡纳霉素等细菌敏感的抗生素来抑制细菌的生长。

经富集培养后的样品，虽然目的微生物得到了增殖，但是培养液中依然是多种微生物混杂在一起。因此，培养液还需通过分离纯化，把需要的菌株从样品中分离出来。下面将分别对几种常用的分离方法进行介绍。

(1)稀释涂布和划线分离法 稀释涂布分离法是指将土壤样品以10倍的级差用无菌水进行稀释，取一定量的某一稀释度的悬乳液，涂布于分离培养基的平板上，经过培养，长出单菌落。

(2)利用平皿中的生化反应进行分离 分离培养基是根据目的微生物特殊的生理特性或利用某些代谢产物的生化反应来设计的，可显著提高菌株分离纯化的效率。

具体的方法有如下几种。

(3)组织分离法 组织分离法是从一些有病组织或特殊组织中分离菌株的方法。如从患恶苗病的水稻组织中分离赤霉菌，从根瘤中分离根瘤菌，以及从各种食用菌的子实体中分离孢子等

(4)通过控制营养和培养条件进行分离 各种微生物对营养和培养条件的要求是不一样的，在分离筛选时，若在这两个方面加以调节和控制，往往能获得更好的分离效果。其原理和方法与富集培养类似。

野生型目的菌株的筛选

在目的菌株分离的基础上，进一步通过筛选，选择具有目的产物合成能力相对高的菌株。一般可分为初筛和复筛两步。

       (1)初筛 初筛是从大量分离到的微生物中将具有合成目的产物的微生物筛选出来的过程。由于菌株多，工作量大，为了提高初筛的效率，通常需要设计一种快速、简便又较为准确的筛选方法。初筛一般分为平板筛选和摇瓶发酵筛选两种。在初筛时，使用平板筛选，将复杂而费时的化学测定改为平皿上肉眼可见的显色或生化反应，能较大幅度地提高筛选效率。由于摇瓶振荡培养法更接近于发酵罐培养的条件，效果比较一致，由此筛选到的菌株易于推广。因此，经过平板定性筛选的菌株还需进行摇瓶培养。一般一个菌株接一个瓶，培养得到的发酵液进行定性或定量测定。初筛可淘汰85%~90%不符合要求的微生物。但是由于初筛多采用定性的测定方法，只能得到产物的相对比较。因此，要得到确切的产物水平，必须进行复筛

        (2)复筛 复筛时，一个菌株通常要重复3~5个摇瓶，培养后的发酵液采用精确的分析方法来测定。在复筛过程中，要结合各种培养条件，如培养基、温度、pH和供氧量等进行筛选，也可对同一菌株的各种培养因素加以组合，构成不同的培养条件来进行试验，以便初步掌握野生型菌株适合的培养条件，为以后的育种工作提供依据。一般经复筛后，可保留2~3株产量较高的菌株来进行后续生产性能方面的检测。

野生型目的菌株的菌株鉴定

经复筛得到的野生型菌株一般都要进行菌种鉴定，为后续研究奠定基础。菌株鉴定一般分为三个步骤:

1、获得该微生物的纯种分离物;

2、测定一系列必要的鉴定指标;

3、根据权威的鉴定手册(如《伯杰氏细菌鉴定手册》)进行菌种鉴定。常用的鉴定指标有:形态结构、生理生化特征、血清学反应和遗传特征等。

适应性进化

     在漫长的进化过程中，微生物经自然选择，能适应它的周围环境和同其他物种的竞争，但往往不能很好地满足工业化生产上的要求，存在对工业过程中不良环境的耐受能力差、底物消耗速率低、合成目标产物量少等问题。因此，必须对现有的工业微生物菌种进行改良使之更好地为人类服务。

     适应性进化(adaptiveevolution)，通常也称为菌种驯化，一般是指通过人工措施使微生物逐步适应某一条件，而定向选育微生物的方法。通过适应性进化可以取得具有较高耐受力及活动能力的菌株。适应性进化作为一种传统的菌种改良手段，在实际生产中有着广泛的应用，特别是在传统发酵、环境保护、金属冶炼等领域。例如，为了提高柠檬酸生产菌对高浓度柠檬酸的耐受能力，可将该菌株在柠檬酸适应性进化培养基中进行耐酸性进化，柠檬酸的浓度从低逐步提高，这样经若干次传代后就能得到可耐高浓度柠檬酸的优良菌株。

来源网址：菌种的制备原理与方法