两道高考真题溯源 CRISPR/Cas9 工作原理

 

来源公众号：学甫无境　作者：王甫荣

CRISPR/Cas9系统由sgRNA(单链向导RNA)和Cas9蛋白(具内切核酸酶功能)组成，是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，细菌通过CRISPR序列记录曾经入侵的病毒基因信息，当同一病毒再次入侵时，细菌便能利用Cas9蛋白精准切割病毒DNA，从而保护自身。

一、CRISPR/Cas9系统组成和工作机制

Cas9蛋白：DNA内切酶，负责剪断DNA双链；需要识别PAM才能激活切割活性。含HNH、RuvC 两个内切酶结构域，HNH切与sgRNA互补的DNA链；RuvC切另一条DNA链，造成DNA双链断裂。

PAM是靶DNA上紧邻靶点的保守短序列，是Cas9识别与切割DNA的必要条件；用于区分自身与外源DNA，缺少PAM时Cas9无法启动酶切。

sgRNA（向导RNA）：（1）5′端20核糖核苷酸（nt）：上图中红色区域，由人工建立，通过碱基互补配对，定位靶DNA（导航定位），决定靶点特异性）；（2）骨架区：结合Cas9蛋白。

PAM（在靶DNA上）：Cas9识别必需位点，无PAM不切割（细菌自身DNA无 PAM，避免自切）。

二、利用DNA切口的修复机制实现基因敲除或敲入

人工基因编辑三步，人为设计sgRNA，定点改造动植物或细胞基因，这是高考中的高频考点。

1.定位识别

人工sgRNA+Cas9形成复合体，sgRNA碱基互补配对锁定目标基因位点+Cas9 识别PAM，精准锚定靶点DNA。

2.定点切割

Cas9两个酶结构域剪断DNA双链，产生双链断裂缺口 (DSB)。

3.细胞自主修复（两种修复机制）

非同源末端连接（NHEJ）：无外源同源模板，断裂DNA两端直接胡乱拼接，易随机插入或缺失碱基。修复不准确，易错，恰恰用来敲除基因

同源定向修复（HDR）：提供同源DNA模板，以导入的同源DNA为模板精准修补缺口。精准替换原有序列、或定点插入目的基因＝定点敲入/定点替换。生物反应器、定点改良基因全靠HDR。

三、高考真题解析

高考CRISPR/Cas9命题万变不离三点：①sgRNA负责定位、Cas9负责切割、PAM是切割前提；②双链断裂后的两条修复路径；③敲除/敲入的实验设计差异。依托真题梳理逻辑，跳出死记误区，长句作答不再丢分。

1.(2021·海南卷)CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，Cas9基因表达的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，在单链向导RNA(sgRNA)引导下，切割DNA双链以敲除目标基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9基因编辑技术的工作原理如图所示。

回答下列问题。

（1）过程①中，为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定sgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是______。

答案：DNA连接酶

解析：基因工程所需的工具酶有限制酶和DNA连接酶，限制酶负责切割，DNA连接酶负责连接，因此，为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定sgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是DNA连接酶。

（2）过程②中，将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是______。

答案：感受态细胞法(或CaCl2处理法)

解析：大肠杆菌是原核生物，属于微生物，将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。

（3）过程③～⑤中，sgRNA与Cas9蛋白形成复合体，该复合体中的sgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，二者结合所遵循的原则是______。随后，Cas9蛋白可切割______序列。

答案：碱基互补配对原则　  目标DNA特定的核苷酸

解析：根据题图可知，在CRISPR/Cas9基因编辑技术中，sgRNA是根据靶基因设计的向导RNA，准确引导Cas9切割与sgRNA配对的靶基因DNA序列。Cas9能借助sgRNA分子与目标DNA进行特异性结合的原因在于sgRNA分子上的碱基序列与目标DNA分子上的碱基序列可以通过碱基互补配对原则实现sgRNA与目标DNA特定序列的特定识别，进而定位；由此可见，Cas9在功能上属于限制酶，可切割目标DNA特定的核苷酸序列。

（4）利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除一个长度为1200 bp的基因，在DNA水平上判断基因敲除是否成功所采用的方法是______，基因敲除成功的判断依据是______。

答案：DNA分子杂交技术　不出现杂交带

解析：可利用DNA分子杂交技术判断基因敲除是否成功，若未出现杂交带，则说明基因敲除成功。

（5）某种蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。科研人员将该蛋白酶基因插入到CRISPR/Cas9质粒中获得重组质粒，随后将其导入到大肠杆菌细胞，通过基因编辑把该蛋白酶基因插入到基因组DNA中，构建得到能大量分泌该蛋白酶的工程菌。据图简述CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内，将该蛋白酶基因插入到基因组DNA的编辑过程：______。

答案：CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内进行转录和表达，转录的产物是sgRNA，表达的产物是Cas9蛋白，二者形成复合体，该复合体中的sgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，在特定位点上切割基因组DNA，然后将该蛋白酶基因插入到基因组DNA中

解析：根据图示可知，CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内进行转录和表达，转录的产物是sgRNA，表达的产物是Cas9蛋白，二者形成复合体，该复合体中的sgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，在特定位点上切割基因组DNA，然后将该蛋白酶基因插入到基因组DNA中。

2.(2025·甘肃卷)水稻白叶枯病(植株的叶片上会出现逐渐扩大的黄白色至枯白色病斑)由白叶枯病菌引起，严重威胁水稻生产和粮食安全。科学家利用CRISPR－Cas9基因组编辑技术，对水稻白叶枯病的感病基因SWEET(该基因被白叶枯病菌利用以侵染水稻)的启动子区进行了定点“修改”，编辑后的水稻幼胚通过植物组织培养技术获得抗病植株(如下图)。回答下列问题。

（1）CRISPR－Cas9重组Ti质粒构建完成后，可通过______(方法)将该质粒转入植物细胞，并将______整合到该细胞的染色体上。为了能够筛选出转化成功的细胞，需要在植物组织培养基中添加______。

答案：农杆菌转化法　Ti质粒上的T－DNA　潮霉素

解析：将重组Ti质粒转入植物细胞常用农杆菌转化法。因为农杆菌中的Ti质粒上的T－DNA(可转移DNA)能够整合到植物细胞的染色体DNA上。利用农杆菌侵染植物细胞，从而将重组Ti质粒导入植物细胞。为了筛选出转化成功的细胞，由于重组Ti质粒上含有潮霉素抗性基因(Hyg^R)，所以需要在植物组织培养的培养基中添加潮霉素，只有成功导入重组Ti质粒的细胞才能在含有潮霉素的培养基上存活。

（2）实验中用到的水稻幼胚在植物组织培养中被称为______，对其消毒时需依次使用酒精和______处理。诱导形成再生植株的过程中需使用生长素和细胞分裂素，原因是______。

答案：外植体　次氯酸钠　生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素

解析：在植物组织培养中，离体的植物器官、组织或细胞被称为外植体，所以实验中用到的水稻幼胚被称为外植体。 对水稻幼胚消毒时需依次使用酒精、次氯酸钠处理。 在植物组织培养诱导形成再生植株的过程中，生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素。不同浓度的生长素和细胞分裂素的配比可以调控细胞的分裂和分化方向，从而诱导形成根和芽等不同的器官，最终形成再生植株。

（3）为了检测基因编辑水稻是否成功，首先需采用______技术检测目标基因的启动子区是否被成功编辑；然后，在个体水平需将基因编辑后的水稻与野生型水稻分别接种白叶枯病菌，通过比较______来验证抗病性。

答案：PCR测序(或PCR)　病斑的大小(或病斑面积、发病情况等合理答案)

解析：为了检测基因编辑水稻是否成功，首先需采用PCR测序技术检测目标基因的启动子区是否编辑成功。通过PCR扩增目标基因的启动子区片段，然后进行测序，与编辑前的序列进行对比，看是否发生了预期的改变。 在个体水平需将基因编辑后的水稻与野生型水稻分别接种白叶枯病菌，通过比较病斑的大小(或病斑面积、发病情况等)来验证抗病性。如果基因编辑后的水稻病斑明显小于野生型水稻，说明其抗病性增强。

（4）在该研究中，基因编辑成功后的水稻可以抗白叶枯病的原因为______。

答案：对感病基因SWEET的启动子区进行定点修改后，白叶枯病菌无法利用该基因侵染水稻

解析：在该研究中，基因编辑成功后的水稻可以抗白叶枯病的原因为：对感病基因SWEET的启动子区进行定点修改后，白叶枯病菌无法利用该基因侵染水稻，从而使水稻获得了抗病性。

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